Показания для цитогенетического обследования в постнатальном периоде.

40.  Цитогенетические методы анализа кариотипа (метафазный, поиск полового хроматина), принципы и диагностические задачи.

Под термином «цитогенетика» понимают область науки, изучающей структуру и функции хромосом.

Задачи:

Применение цитогенетического метода позволяет не только изучать нормальную морфологию хромосом и кариотипа в целом, определять генетический пол организма, но, главное, диагностировать различные хромосомные болезни, связанные с изменением числа хромосом или с нарушением их структуры. Кроме того, этот метод позволяет изучать процессы мутагенеза на уровне хромосом и кариотипа. Применение его в медико-генетическом консультировании для целей пренатальной диагностики хромосомных болезней дает возможность путем своевременного прерывания беременности предупредить появление потомства с грубыми нарушениями развития.

Объектом цитогенетических наблюдений могут быть соматические делящиеся, мейотические и интерфазные клетки. Выбор объекта определяется целью исследования.

Большинство цитогенетических исследований выполняют на соматических клетках, поэтому остановимся на описании этих методов.

Окраска препаратов

Следующая стадия цитогенетических методов - окраска препаратов. Методы окраски бывают простыми, дифференциальными, флюоресцентными.

Наиболее распространен метод окраски по Гимзе, или простая окраска «рутинная окраска»). Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине. При этом контурируются центромера, спутники (иногда со спутничными нитями) и вторичные перетяжки. Механизм связывания красителя Гимзы хромосомами неясен. Он не является специфичным для какого-либо азотистого основания ДНК.

При простой окраске возможна только групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа. Структурные хромосомные аномалии (делеции, транслокации, инверсии), выявляемые при простой окраске, должны быть идентифицированы с помощью дифференциальной окраски. Простая окраска широко применяется для изучения хромосомного мутагенеза (учет хромосомных аберраций) при проверке факторов окружающей среды на мутагенность.

Метод простой окраски хромосом как единственный метод изучения кариотипа человека применялся до начала 70-х годов XX в. С его помощью за 10 лет были открыты основные хромосомные болезни, показана роль хромосомных аномалий в спонтанных абортах, врожденных пороках развития и канцерогенезе, разработаны принципы биологической дозиметрии.

В 70-х годах в практику вошли методы дифференциального окрашивания.

Под дифференциальной окрашиваемостью хромосом понимают их способность к избирательному окрашиванию по длине без прижизненной модификации какими-либо воздействиями. Дифференциальное окрашивание хромосом обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в чередовании эу- и гетерохроматиновых районов (темные и светлые полосы). Протяженность этих участков специфична для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Каждая хромосома имеет свой рисунок исчерченности. При дифференциальной окраске метафазных хромосом вкариотипе можно оценить около 200-400 участков (разрешающая способность метода), на стадии прометафазы - до 2000. Наиболее широко используется G-окраска (по Гимзе). Хромосомы нужно предварительно обрабатывать (инкубация в солевом растворе либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, в некоторых участках она восстанавливается при окраске, что и придает хромосоме индивидуальную исчерченность. Механизм образования сегментов поканедостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты - это гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся участки хромосом с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные - это эухроматиновые участки, в которых расположены кодирующие последовательности.

Для идентификации хромосом, помимо методов выявления линейной структурной дифференцированности, можно воспользоваться одной из важных характеристик хромосом человека - асинхронностью их репликации по длине. «Рисунки» последовательности репликации (рано или поздно реплицирующиеся участки) специфичны для каждой хромосомы. Для выявления последовательности репликации применяется аналог тимидина - 5-бромдезоксиуридин. Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо. Используя этот метод, можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку.

5-бромдезоксиуридин вводят в культуру на 24 ч и более для дифференциальной окраски сестринских хроматид. Если 5-бромдезоксиуридин ввести на полный клеточный цикл, то вновь образуемая хроматида включит аналог тимидина и будет окрашиваться слабо. Другая хроматида (старая) окрашивается, как обычно, интенсивно. Этот метод позволяет легко выявлять обмены между сестринскими хроматидами, число которых увеличивается при наследственных болезнях с хромосомной нестабильностью (анемия Фанкони, пигментная ксеродерма и др.). Число обменов сестринских хроматид увеличивается также при мутагенных воздействиях, поэтому метод учета обменов сестринских хроматид широко используется при изучении мутационного процесса у человека.

Показания для проведения цитогенетических исследований

- Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза).

- Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не относящихся к генному синдрому.

- Многократные (более двух) спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с врожденными пороками развития.

- Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

- Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка.

- Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью).

- Подозрение на синдромы с хромосомной нестабильностью (учет хромосомных аберраций и сестринских хроматид).

- Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза).

- Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических).