Методы молекулярной диагностики. Общие понятия.

Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, в конечном счете предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70-80-х годах XX в. и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы прочно вошли в медико-генетическую практику. Для идентификации и поиска ДНК-полиморфизмов (мутаций) применяются уже более 100 разных методов. Однако широко используется только незначительная их часть.Ниже схематично описаны основные этапы и варианты молекулярно-генетических методов. Освоение этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует специальной подготовки в соответствующих лабораториях.

Получение образцов ДНК (или РНК) - первый этап всех методов. Он включает выделение всей ДНК (тотальной или геномной) и клеток или накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью ПЦР.

Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэтому такие образцы называют геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется небольшое количество биологического материала, например 20-40 мг хориона, 1 мл крови, 5-10 мг культуры клеток. При использовании некоторых методов достаточно иметь одну каплю крови или соскоб эпителия со слизистой оболочки щеки либо несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала - преимущество методов этой группы. Можно добавить, что выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.

В большинстве случаев для успешной диагностики болезни или гетерозиготного состояния достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Необходимо получить достаточное количество таких фрагментов, т.е. амплифицировать (умножить) их. Ранее решение этой задачи было трудоемким: создание рекомбинантной плазмиды введение плазмиды в бактериальную клетку размножение бактериальных клеток - выделение заданных фрагментов ДНК. Теперь накопление нужных фрагментов ДНК обеспечивает ПЦР. Открытие этой реакции совершило революцию в изучении генома человека и молекулярно-генетической диагностике наследственных болезней.

24.  Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основные понятия (принцип, температурные режимы, состав буфера).

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне.

Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции.

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

1. Выделенную ДНК из исследуемого образца,

2. Буферный раствор,

3. Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

4. Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

5. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

6. Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

1. Денатурация (температура 94оС) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

2. Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60оС) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

3. Элонгация (температура обычно 72оС) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР

25.  Цели и принцип проведения реакции ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).

На первом этапе процедуры производится выделение ДНК из биологического материала пациента (как правило, это кровь). Дальнейшая работа ведется в крошечной пробирке с очень маленьким объемом образца. Генетический материал обрабатывают ферментом, который разрезает его в определенных местах. Этот фермент называется рестриктазой, и он очень специфичен к конкретному участку ДНК. Фермент подбирают таким образом, чтобы специфичный к нему участок потенциально содержал ту мутацию в гене, которая провоцирует искомое заболевание.

Таким образом, если мутация есть, и пациент болен, то произойдет разрезание ДНК, получится два фрагмента. Если же генетический материал данного нарушения не содержит, то он останется первоначальной длины.

После обработки ДНК ферментом, её размножают при помощи ПЦР и подвергают гель-электрофорезу. В результате этой процедуры участки ДНК разной длины располагаются на разных уровнях. В итоге исследователю становится четко видно, имеет он дело с двумя короткими фрагментами ли одним длинным..

При обследовании пациентов и членов их семей на носительство патологических генов широко используют этот метод, с помощью которого:

· идентифицируют делеции в гене дистрофина, на долю которых приходится около 60% всех мутаций, вызывающих миодистрофию Дюшенна;

· диагностируют гемофилию А, некоторые та-лассемии, ретинобластому и гранулематоз;

· контролируют здоровье детей в семьях, в которых родители являются гетерозиготами по гену серповидно-клеточной анемии и другим дефектным генам.

26.  Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP), цели и принцип проведения.SSCР (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК - основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однони-тевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул (рис. 9.17). Конформация небольших однонитевых ДНК зависит от нуклеотидной последовательности, поэтому замена даже одного нуклеотида приводит к изменению пространственной структуры. Метод включает амплификацию фрагментов ДНК размером до 300 пар нуклеотидов, денатурацию продуктов ПЦР и высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле.

Конформационный метод выявления точковых мутаций получил широкое распространение вследствие относительной простоты и способности обнаруживать любые типы замен. Ограничением является размер исследуемого фрагмента ДНК, так как высокая эффективность детекции мутаций, составляющая 80-90%, показана при длине фрагментов менее 200 пар нуклеотидов, а для фрагментов более 400 пар нуклеотидов вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

В настоящее время разрешающая способность метода значительно повышена. В частности, разработаны подходы для идентификации точковых мутаций методом SSCP-анализа в амплифицирован-ных фрагментах ДНК размером до 800 пар нуклеотидов. Для этого используется полиакриламидный гель с низким pH.