Тонкослойной хроматографии в контроле качества лекарств

ИОХ. Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке: IgG (как правило, имеет несколько пиков), р -, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgG высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки.

Примерно столько же времени занимает определение фтор-иона в криолите с применением ионообменной хроматографии. Навеска криолита (0,1-0,12 г) растворяется в 300 мл воды при нагревании до кипения и переносится в мерную колбу ёмкостью 500 мл.

Известно измерение низкого суммарного содержания эстрона и lip-эстрадиола в моче с применением ионообменной хроматографии.

Опубликовано разделение селена и теллура с применением ионообменной хроматографии, с использованием для этого катионит КУ-1 в Н-форме. Установлено, что из раствора с рН=1,4 селен полностью переходит в фильтрат, а теллур сорбируется. При рН 1,5-:-3,7 полностью сорбируются медь, железо, свинец и цинк, что позволяет отделить селен от этих элементов; содержание селена в фильтрате определяют полярографическим методом.

Наблюдается дальнейшее расширение областей применения ионообменной хроматографии в практике контрольных химико-аналитических, научно-исследовательских и заводских лабораторий, а также учебных институтов.

Известны работы по применению ионообменной хроматографии для микроколичественного определения пестицидных остатков и микроэлементов.

Помимо рассмотренных случаев ионообменная хроматография часто используется в сочетании с другими методами разделения при анализе лекарственных веществ.

Содержание натрия цитрата в субстанции можно определить например ионообменной хроматографией. Извлечённую ли­монную кислоту титруют щелочью по фенолфталеину (фармакопейный метод).

В настоящем сборнике Трудов комиссии по хроматографии помещены оригинальные исследования и обзорные статьи по вопросам применения ионообменных смол в медицинской и пищевой промышленности, а также некоторым вопросам теории применения ионообменной хроматографии.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медицине, биологии, биохимии, для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для разделения неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и т.д. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии проводят за 20-40 мин с лучшим разделением. Применение ионообменной хроматографии в биологии позволило наблюдать за образцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к неправильной интерпретации конечного результата. Интересно использование данного метода для контроля изменений, происходящих с биологическими жидкостями. Применение пористых слабых анионообмеников на силикагелевой основе позволило разделить пептиды.

Распределительная хроматография на ионообменных смолах была с успехом применена для разделения моно- и олигосахаридов, альдитов и производных сахаров, не содержащих ионогенных группировок, например гликозидов и частично метилированных сахаров. Этот метод можно использовать как в аналитических, так и в препаративных целях.

ТСХ. Качественный анализ по хроматограммам не вызывает затруднений, если определяемые вещества сами образуют характерно окрашенное пятно на хроматограмме или же окрашивание появляется в результате взаимодействия с каким-либо реагентом. Однако такими свойствами обладает весьма ограниченное количество соединений, особенно органических. Если и удается получить характерную окраску для органических соединений в результате опрыскивания пластинки соответствующим реагентом, то только для того или иного класса соединений в целом, тогда как разные соединения, относящиеся к одному классу, дают одинаковое окрашивание, обусловленное наличием определённой функциональной группы.

В большинстве случаев качественный анализ проводят либо вымыванием с пластинки вещества с последующим анализом раствора одним из подходящих физических, физико-химических или химических методов, либо по хроматограммам на основании измерений значений подвижности R_f и сравнения их с табличными данными или же с данными, полученными для известного вещества в тех же условиях (свидетель).

Первый способ чрезвычайно громоздок и обладает рядом неудобств. Поэтому он имеет очень ограниченное применение. Наряду с чувствительностью к изменениям свойств веществ R_f существенно зависит и от условий эксперимента. Это обстоятельство накладывает ряд ограничений в идентификации соединений по R_f и требует дополнительных мер, исключающих или доводящих до минимума влияние посторонних факторов.

В первую очередь необходимо строго соблюдать стандартные условия для проведения эксперимента. Многими аналитиками в качестве стандартных приняты следующие условия:

1. Формат пластинки 20x20 и 10x20 см.

2. Толщина сухого слоя сорбента 0,1-0,3 мм. При этом следует иметь в виду, что до сушки слой сорбента должен иметь большую величину, так как при высыхании толщина его уменьшается. Рекомендуется, например, для силикагелей, устанавливать толщину слоя наносимой пасты 0,25 мм.

3. Предварительная сушка при комнатной температуре 10 мин и потоком горячего воздуха при 110 °С в течение 30 мин.

4. Готовые пластинки хранят в эксикаторе над силикагелем.

5. Расстояние стартовой линии от края пластинки 1,5 см; расстояние крайних точек проб от краёв пластинки по 1 см.

6. Объём наносимой пробы вещества 1-5 мкл.

7. Глубина погружения пластинки в подвижную жидкую фазу при методе восходящей хроматографии 0,5-0,8 см.

8. Длина пути фронта растворителя от стартовой линии при вертикальном положении пластинки 10 см.

9. Камера должна быть герметизирована и насыщена парами растворителя.

10. Температура опыта 18-25 °С.

11. Сорбенты применяются только стандартные.

12. Растворители применяются только очищенные.

При соблюдении этих требований можно получать достаточно однозначные и воспроизводимые значения R_f. Однако сравнивать их с табличными данными можно только в том случае, если известно, что табличные данные получены в тех же условиях.

Единственным надёжным методом качественной идентификации соединений по хроматограммам, позволяющим избежать влияния всевозможных, в том числе и случайных, факторов на значение R_f, является метод свидетелей, когда вместе с пробой исследуемого вещества (или смеси) на стартовую линию в таких же количествах наносятся пробы индивидуальных веществ, соответствующих предполагаемым компонентам смеси, В этом случае влияние постоянных и случайных факторов на значение R_f как веществ свидетелей, так и компонентов смеси одинаково. Поэтому совпадение значений R_f испытуемых веществ и взятых в качестве свидетелей даёт основание отождествлять искомое соединение с известным, взятым в качестве свидетеля.

Количественный анализ. Из всех операций в ТСХ количественное определение содержания вещества в пятне является наиболее ответственным. Оно может проводиться двумя способами: непосредственно на пластинке и вне её, после удаления вещества.

Первый способ является наиболее простым и быстрым, но требует строгого выполнения стандартных условий опыта.

Определение по площади пятна. Если пятно достаточно контрастно и не имеет диффузных краев, то площадь такого пятна можно измерить с большой точностью. Для этого пятно фотографируют и измеряют его площадь планиметром или же переносят контур пятна на миллиметровую кальку и подсчитывают площадь. Предварительно проводят калибровку по чистым индивидуальным веществам: на слой сорбента наносят различные, но точно известные количества вещества, затем хроматографируют, соблюдая стандартные условия опыта. Этот метод достаточно быстр и точен: при тщательном выполнении эксперимента относительная ошибка составляет 6-8%.

Значительно более совершенным является метод, основанный на денситометрии и флюориметрии пятен. Хотя метод требует применения специальных приборов - денситометров и флюори-метров, его достоинствами являются высокая скорость измерений, отсутствие дополнительных операций и относительно высокая точность. Следует иметь в виду, что на воспроизводимость результатов измерений сильно влияют характер и интенсивность окраски пятен.

Относительная ошибка измерений лежит в пределах 5-8%.

Флюориметрический метод является наиболее чувствительным методом анализа в ТСХ. Определение количества вещества в пятне этим методом можно проводить двояко: во- первых, измерением флюоресценции комплексных соединений, образующихся при взаимодействии исследуемого вещества с флюорогенным реагентом, вводимым при опрыскивании пластинки проявителем. Во-вторых, по гашению флюоресценции введенного в слой сорбента флюорохрома в зоне пятна за счёт поглощения света возбуждения анализируемым веществом. В последнем случае необходимо равномерное распределение флюорохрома в слое сорбента. Наилучшие результаты в этом способе флюориметрии могут быть получены при использовании возможно более тонких слоев сорбента, хотя при этом снижается чувствительность определения. Относительная ошибка измерений 3-8%.

Спектрофотометрия пятен. Для количественной оценки содержания вещества в пятне пластинку подвергают прямому спектрофотометрированию с помощью специальных приборов - спектроденсиметров. Пластинку помещают вертикально между источником УФ излучения и щелью спектрофотометра, который снабжен сканирующим устройством, так что пятно может быть просвечено по всей его длине или ширине. О количестве вещества судят по интенсивности поглощения в максимуме пика по соответствующей градуировке.

Количественное определение методом удаления вещества с пластинки. Удаление вещества с пластинки производится как для количественного определения, так и для препаративного выделения. Удаление может достигаться двумя путями: вымыванием вещества растворителем (проточная нисходящая хроматография) и снятием слоя сорбента, содержащего вещество, с пластинки. В первом случае стекающий с пластинки растворитель собирают отдельными порциями, в которых и определяют вещество тем или иным аналитическим методом. Этот способ применяется сравнительно редко. Чаще вещество удаляют вместе с сорбентом после того, как вследствие окрашивания пятна или возникновения флюоресценции определятся его границы.

При работе с закреплённым слоем сорбент удаляют с пластинки и экстрагируют из него вещества. Для удаления сорбента предложено довольно большое число приспособлений.

Метод удаления вещества с пластинки с последующим анализом считается наиболее точным. Однако он трудоёмок и требует большой аккуратности во избежание потерь вещества. Кроме того, необходимо учитывать ряд факторов, способных вызвать значительные погрешности при анализе. К ним, в частности, относятся чистота сорбента, так как примеси при экстрагировании могут перейти в раствор и исказить результаты анализа. Те же требования предъявляются и к чистоте растворителей, применяемых для экстракции. Погрешность в результате анализа зависит также от метода последующего определения. При использовании колориметрических методов относительная ошибка обычно составляет 1-5%. Спектрофотометрический метод дает примерно 5%, а флюориметрический 3-8%, в отдельных случаях до 15%.

При анализе на закреплённом слое погрешность в определении может возникать вследствие загрязнений в связующем веществе.

Для определения весьма малых количеств вещества в тонком слое иногда применяют масс-спектрометрию. В этом случае после удаления вещества от сорбента и экстрагента его помещают в тонкий стеклянный капилляр и переносят в камеру масс-спектрометра. После откачки воздуха и нагрева вещество испаряется, попадает в электронный пучок источника и анализируется.

Одно из интересных сочетаний ТСХ с газовой хроматографией описано Кайзером. Пластинку, покрытую тонким слоем сорбента, помещают непосредственно под капилляр, из которого выходят газ-носитель и десорбированное вещество из газовой хроматографической колонки. Пластинку располагают так, что вещества по выходе из колонки попадают на стартовую линию и сорбируются. По мере выхода веществ из колонки пластинку передвигают вдоль стартовой линии. Передвижение пластинки можно осуществлять несколькими методами: периодически, непрерывно, с постоянной скоростью и непрерывно с уменьшающейся скоростью.

Сочетание электрофореза с ТСХ существенно расширяет возможности хроматографического разделения смесей, особенно неорганических ионов. В этом случае разделение может быть обусловлено различием устойчивости комплексных соединений, образующихся при взаимодействии ионов с электролитом, необходимым для создания токопроводящей среды. Для ионов щелочных металлов разделение обусловлено неодинаковой степенью ассоциации этих ионов с анионами электролита. Сочетание электрофореза с ТСХ возможно также в ряде случаев разделения и анализа смесей органических соединений. Решающим при сочетании ТСХ и электрофореза является правильный выбор электролита, которым предварительно пропитывается тонкий слой сорбента. Из сорбентов для проведения электрофореза в тонком слое наиболее часто применяют целлюлозу и силикагель. Однако работают также на ацетилцеллюлозе, кварцевом песке, кизельгуре, смеси тефлона с целлюлозой. Органические соединения разделяют на кизельгеле.

В процессе хроматографирования на пластинку накладывают высокое напряжение, от 5-8 до 50-60 В на 1 см длины слоя, в зависимости от толщины слоя сорбента, электрической проводимости электролита, расстояния между электродами и других факторов. Сочетание ТСХ с электрофорезом улучшает разделяющую способность системы и значительно ускоряет процесс.

Возможности ТСХ расширяются, если перед хроматографированием подлежащую анализу смесь подвергнуть экстракции хелатообразующими элементами, т.е. веществами, дающими внутрикомплексные соединения с ионами металлов. Перед хроматографическим анализом какой-либо смеси электролитов исследуемый раствор обрабатывают выбранным экстрагентом. Образовавшиеся внутрикомплексные соединения экстрагируют, наносят пробу на стартовую линию пластинки, хроматографируют и проявляют. Очень часто внутрикомплексные соединения обладают собственной окраской, что значительно облегчает идентификацию непосредственно на пластинке. Сочетание экстракции и ТСХ позволяет проводить весьма тонкое разделение смеси очень близких по свойствам и строению соединений, например, цис- и транс-изомеров. ТСХ можно комбинировать с рядом других химических и инструментальных методов и решать сложные задачи анализа.

Вопросы и тесты для контроля усвоения знаний

1. Понятие о хроматографии. Какова роль отечественных ученых в развитии хроматографического метода анализа?

2. Каковы особенности хроматографических процессов?

3. Каковы необходимые условия разделения компонентов смеси?

4. Какие основные виды хроматографий Вам известны? На чем же основаны данные виды хроматографий?

5. Какие существуют классификации хроматографий?

6. На чем основана проявительная и фронтальная хроматография?

7. Вытеснительный и комбинированный методы хроматографии.

8. Расскажите об основных частях хроматогрофа.

9. Термокондуктометрические и ионизационные детекторы.

10. На чем основана газожидкостная хроматография?

11. Теории линейной и равновесной хроматографии.

12. Какие Вам известны хроматографические параметры?

13. Приведенные параметры удерживания.

14. Абсолютные и относительные параметры удерживания.

15. Что такое индекс удерживания Ковача?

16. Чем характеризуется эффективность колонки?

17. От каких факторов зависит селективность колонки?

18. Какие вы знаете подвижные, неподвижные фазы и детекторы различных хроматографических методов анализа?

19. На чем основан количественный хроматографический анализ?

20. Что из себя представляет высокоэффективная жидкостная хроматография?

21. Что входит в комплект современного оборудования для ВЭЖХ?

22. Методы абсолютной градуировки и внутренней нормализации. На чем основаны?

23. Метод внутреннего стандарта. На чем основан?

24. Приведите примеры использования методов ГЖХ и ВЭЖХ в медицине?

25. Сущность ионообменной хроматографии. На чем основана? Характеристика.

26. Назовите методы ионообменной хроматографии.

27. Иониты. Характеристика. Классификация.

28. Типы и свойства ионитов.

29. Аппаратура и подготовка ионита.

30. Дайте характеристику распределительной хроматографии на ионообменных смолах.

31. На чем основана тонкослойная хроматография?

32. Назовите теоретические основы и возможные методические варианты ТСХ?

33. Какие сорбенты перспективны для использования в ТСХ?

34. Классификация растворителей, используемых при хроматографировании.

35. Качественный и количественный анализ при ТСХ.