Растворители, применяющиеся в адсорбционной ТСХ

 

Анализируемые вещества	Растворитель
Олефиновые углеводороды	Гексан
Антрацен и его производные	Метанол, диэтиловый эфир, вода (4:4:51)
Алифатические спирты	Бензол, диэтиловый эфир(2:3)
Алифатические альдегиды	Бензол, вода(49:4)
Карбоновые кислоты	Пиридин, петролейный эфир(1:2)
Фенолы	Хлороформ, ксилол(3:1)
Углеводы	Толуол, этилацетат, этанол 96% (2:1:1)
Аминокислоты	н-Бутанол, уксусная кислота (ледяная), вода (4:1:1)
Тиофен и его производные	Петролейный эфир
Полярные производные тиофена	Бензол, хлороформ (9:1)
Алкалоиды группы индола	Метанол, метилэтилкетон, гептан (4,2:16,8:2,9)

 

Для окончательного выбора растворителя можно пользоваться микроциркулярным способом. Он состоит в следующем: на пластинку с выбранным сорбентом наносят несколько проб исследуемой смеси на расстоянии 2 см друг от друга. После того, как проба впитается, в центр первой зоны наносят один из выбранных растворителей. В центр другой зоны - следующий растворитель и т.д. После хроматографирования растворители испаряют, а хроматограмму проявляют. При этом образуются концентрические кольца. По результатам разделения выбирают наиболее подходящий растворитель.

В распределительном варианте ТСХ при выборе растворите-лей, работающих в качестве подвижной фазы, необходимо одновременно учитывать природу жидкости, нанесенной на твердый носитель в качестве неподвижной фазы. Обе системы не должны взаимно растворяться. Полезно пользоваться каким-либо из известных растворителей, расположенных в порядке возрастания способности к образованию водородных связей.

Если неподвижной фазой в тонком слое служит вода, хроматографированию подвергают полярные соединения, а в качестве подвижной фазы выбирают органический растворитель или систему органических растворителей, нерастворяющихся в воде. Растворитель предварительно насыщают водой.

Для разделения смесей неполярных, гидрофобных веществ в качестве неподвижной фазы наносят лиофильные вещества - парафины, силиконовые масла, а подвижной фазой выбирают полярные органические растворители.

Вещества средней полярности хроматографируют на нелетучих полярных жидкостях, например, на формамиде, полиэтиленгликоле. Подвижной фазой служат неполярные растворители, такие как хлороформ, алканы. Их предварительно насыщают веществом неподвижной фазы. При разделении смесей ионов металлов в тонком слое на ионообменниках растворителями служат водные растворы кислот.

Изменяя значение pH растворов, можно подбирать оптимальные условия разделения.

Техника эксперимента

Подготовка пластинок. Размер пластинок определяется задачей эксперимента, количеством анализируемой пробы. Материалом для пластинок кроме стекла могут служить пассивированная алюминиевая фольга, пластмасса, полиэфирные плёнки.

Пластинки из любого материала должны быть предварительно тщательно обезжирены и промыты водой очищенной. Стеклянные пластинки рекомендуется промывать хромовой смесью. Обезжиренные, промытые и высушенные пластинки надо предохранять от пыли и загрязнений, особенно органическими соединениями. Хранить их следует в эксикаторе.

Приготовление и нанесение массы сорбента. Главная задача при изготовлении пластинок с тонким слоем сорбента заключается в получении слоя определённой и одинаковой толщины на всей площади. При изготовлении пластинок с закреплённым слоем предварительно приготовленную массу сорбента с закрепителем можно намазывать на пластинку вручную или при помощи специального прибора, наливать на пластинку в виде суспензии или же наносить путем опрыскивания пластинки разбавленной суспензией сорбента или погружением пластинки в суспензию.

Для получения незакрепленного слоя подготовленный сорбент насыпают на пластинку (лучше матовую) и выравнивают слой валиком, имеющим на концах утолщения, которые и определяют толщину слоя сорбента. Следует иметь в виду, что расстояние между утолщениями на концах валика должно быть на 10-12 мм меньше ширины пластинки, чтобы края пластинки на 5-6 мм были свободны от сорбента.

Приготовленные любым способом пластинки должны быть затем высушены и активированы. Предварительно сушку проводят на воздухе при комнатной температуре. Затем пластинки помещают в сушильный шкаф в вертикальном (для закрепленного слоя) или горизонтальном (для незакрепленного слоя) положении и сушат 30 мин при 110 °С. Для активации сорбентов типа силикагеля и оксида алюминия их дополнительно нагревают 3-4 ч при 150 °С.

Как уже говорилось, ТСХ может применяться и как распределительная хроматография. Для приготовления пластинок в этом случае неподвижную жидкую фазу наносят на твердый носитель после того, как пластинка покрыта закреплённым слоем. Например, если неподвижной жидкой фазой служит вода, то приготовленную пластинку выдерживают над сосудом с кипящей водой до насыщения сорбента. Затем пластинку оставляют на воздухе до полного намокания слоя, после чего её применяют для анализа.

ТСХ применяется также и при разделении смеси веществ методом гель-хроматографии. Для этого готовят слой декстран-геля (сефа-декса). Сефадекс взбалтывают в дистиллированной воде и дважды декантируют. Полученную суспензию наносят на пластинку обычным способом слоем толщиной 0,2 мм. Пластинку сушат на воздухе при комнатной температуре до появления явной структуры геля.

Техника нанесения пробы анализируемого вещества. Решающую роль в получении чётких хроматограмм и, особенно в количественных расчётах играют и количество нанесённой пробы, и правильное её нанесение на слой сорбента. Применяются два способа: нанесение пробы в виде точки и в виде полосы. Последним способом пользуются, главным образом, в препаративной хроматографии. Пробы наносят на стартовую линию, расположенную на расстоянии 1,5 см от края сорбента. Расстояние между отдельными пробами, нанесенными в виде точек, должно быть не менее 1 см.

Немаловажен вопрос об объёме наносимой пробы. Слишком малые пробы могут быть не замечены при проявлении, чрезмерно большие вызывают значительное размывание и перекрывание пятен. Поэтому предварительно на пластинку с выбранным сорбентом наносят ряд проб разной величины исследуемого вещества, хроматографируют, проявляют и определяют оптимальное количество. Величина и форма пятна (рис. 4) зависят от количества нанесённого вещества. Лучший результат хроматографирования (в данном случае глицина) достигается при массе пробы порядка 0,5-1,0 мкг.

Рис. 4. Зависимость значения R_f и формы пятна от массы

нанесённой пробы вещества (q).

 

Кроме того, величина пробы влияет на значение R_f. Большие пробы приводят к заниженным значениям R_f.

Пробы органических веществ наносятся на слой сорбента в виде растворов в летучих растворителях: эфире, хлороформе, ацетоне и т.д., иногда в виде очень разбавленных растворов. Пробу наносят в виде капли при помощи микропипеток, специально калиброванных капилляров, микробюреток, микрошприцев типа "Агла", "Гамильтон".

Типичный прибор для проведения ТСХ анализа приведён на рис. 5.

 

Рис. 5. Типичный прибор для проведения ТСХ анализа.

 

В комплект для ТСХ типа КТХ-01 входят шприцевой дозатор, который позволяет нанести на пластинку одновременно до пяти проб, сильфонное дозирующее устройство, состоящее из сильфонного насоса и набора пипеток. Это устройство применяется при нанесении ядовитых или радиоактивных веществ. Для нанесения проб сильно разбавленных растворов применяют автоматический дозатор, также входящий в комплект КХТ-01.    

Нанесение пробы требует большой тщательности и аккуратности, особенно при количественных определениях.

Главным источником ошибок при количественных расчётах (±6-20%) являются неточности измерения объёма наносимой пробы. При нанесении капли на слой бывает нелегко отделить очень малые объёмы раствора от кончика иглы шприца.

Требуется большой опыт, чтобы не повредить при этом поверхность сорбента. Повреждение приводит к искажению формы пятна и затрудняет количественные измерения.

Кроме того, источником ошибок является растекание вещества по поверхности иглы шприца. При пользовании микропипеткой, откалиброванной с учётом таких ошибок, степень точности повышается. В адсорбционной ТСХ следует также учитывать размывание, обусловленное нелинейностью изотермы адсорбции и возникающие при этом дополнительные погрешности, связанные с измерением площади пятна.

Техника хроматографирования. На стеклянную, металличес-кую или пластмассовую пластинку наносят в виде тонкого слоя сорбент. Затем на один из концов пластины, отступив 2-3 см от края, на так называемую стартовую линию вносят небольшую пробу жидкости, содержащей анализируемые вещества. Далее край пластинки ниже стартовой линии погружают в растворитель, выполняющий функцию подвижной фазы.

Растворитель вследствие действия капиллярных сил движется вдоль тонкого слоя сорбента и переносит компоненты анализируемой смеси с различной скоростью, определяемой свойствами системы сорбат-сорбент. Вследствие этого происходит разделение смеси веществ на составляющие её компоненты.

Для хроматографирования применяются камеры, размеры и конструкции которых зависят от размеров пластинок, способа хроматографирования и наличия закреплённого или незакреплённого слоя сорбента.

При хроматографировании на закреплённом слое пластинки в камере устанавливаются вертикально.

В методе восходящей хроматографии камерой может служить любой стеклянный, герметически закрывающийся и подходящий по размеру сосуд с плоским дном. В такой сосуд наливают соответствующий растворитель так, чтобы нижний край слоя сорбента на пластинке был погружен на глубину 5 мм. Пластинку помещают в сосуд вертикально и укрепляют при помощи подставки, изготовленной из стекла. Если требуется, то в сосуд можно поместить несколько пластинок. Камера должна быть насыщена парами применяемого растворителя. С этой целью на стенку камеры прикрепляют смоченную растворителем и опущенную в него одним концом полоску фильтровальной бумаги, а камеру закрывают пришлифованной крышкой. Если для проведения опыта необходима строго постоянная температура или температура, отличающаяся от комнатной, камеру устанавливают в термостат.

Обычно опыт прекращают после подъёма растворителя на 10-11 см. Затем пластинку вынимают из камеры, отмечают положение линии фронта растворителя и сушат в токе воздуха в вытяжном шкафу вдали от открытого огня. Если необходимо нагревание, применяют ИК-лампу.

Метод нисходящей хроматографии требует подачи растворителя в верхнюю часть пластинки. Поэтому пластинки в камере устанавливаются в держателе вертикально, причем стартовая линия находится вверху. Растворитель наливают в отдельный сосуд и закрепляют его в верхней части камеры. Подача растворителя осуществляется при помощи фитиля или полоски фильтровальной бумаги, один конец которой опускается в растворитель, а другой закрепляется на верхнем крае слоя сорбента. Метод нисходящей хроматографии применяют и как проточный, т.е. дают растворителю стекать со слоя, а растворитель подают непрерывно. В таком случае в камере должно быть предусмотрено устройство, позволяющее собирать отдельные порции растворителя. Проточный метод можно проводить на пластинке, расположенной горизонтально.

В круговой хроматографии применяют прибор, состоящий из небольшого кристаллизатора (или чашки Петри), в который наливают растворитель. Пластинка с сорбентом имеет в центре отверстие диаметром 2 мм. Пробу для анализа наносят в виде кольца вокруг этого отверстия. В отверстие вставляют фитиль, который опускают в растворитель. Пластинкой слоем вниз закрывают кристаллизатор и производят хроматографирование. Опыт прекращают, когда от фронта растворителя до края кристаллизатора остается 1,5-2 см.

В градиентной хроматографии при переменном составе растворителя применяют специальные камеры, на дне которой установлена магнитная мешалка для непрерывного перемешивания растворителя изменяющегося состава. Растворитель подается в камеру через капилляр. Для поддержания постоянного уровня растворителя служит сифон.

Пластинка с закреплённым слоем сорбента устанавливается на решетке с таким расчётом, чтобы стартовая линия находилась на расстоянии 1 см от уровня растворителя. Для предохранения слоя сорбента от разрушения при перемешивании нижний край пластинки покрывают листком фильтровальной бумаги и закрепляют его резиновым кольцом. Камера герметизируется. В таком устройстве можно подавать растворитель с непрерывно изменяющейся концентрацией составляющих или проводить непрерывное изменение pH раствора и т.д.

Хроматография на незакрепленном слое. В этом случае пластинка не может быть установлена в камере вертикально. Угол наклона пластинки к горизонтальной поверхности не должен превышать 20°. Поэтому и аппаратура для работы с незакрепленным слоем должна соответствовать этому требованию. В качестве камер обычно применяют кристаллизаторы.

Для работы по методу восходящей хроматографии можно применять обычный кристаллизатор диаметром 25-30 см и высотой 6-8 см, с пришлифованным стеклом вместо крышки. Пластинку помещают на Т-образную подставку, изготовленную из стеклянной палочки. Одним концом подставка упирается в стенку камеры, а другим в стеклянные полоски 2x13 и 1x13 см, плотно прижатые друг к другу. Между краями этих пластинок помещают тефлоновую пленку или тонкое предметное стекло, а пластинки скрепляют проволокой. В таком случае между пластинками образуется капиллярное пространство, по которому и подается растворитель к пластинке. Последняя устанавливается так, чтобы нижним ребром она упиралась на выступ, образуемый двумя стеклянными полосками, а верхним на подставку.

При наклоне пластинки под углом не более 20° длина пробега не влияет на скорость движения растворителя и, следовательно, на R_f, поэтому пластинки могут иметь достаточно большую длину, а фронт растворителя можно доводить почти до верхнего края слоя сорбента.

Растворитель наливают на дно камеры, которую закрывает пришлифованным стеклом и начинают хроматографирование. По окончании опыта отмечают линию фронта на слое. Для этого легко постукивают по ребру пластины. При этом сухой сорбент ссыпается и линия фронта становится отчетливой. Такие устройства могут применяться и при работе с закреплённым слоем.

При работе по методу нисходящей хроматографии с незакреплённым слоем требуется специальное устройство. Сосуд с растворителем устанавливают в кристаллизаторе на подставке так, чтобы растворитель мог подаваться в верхнюю часть пластинки. Подача и слив растворителя (при проточном методе) происходят по фитилям из фильтровальной бумаги, помещаемым в щели. Пластинку помещают на раму и устанавливают в кристаллизаторе под углом 15-20°. Кристаллизатор герметизируют, после чего производят хроматографирование, останавливая движение фронта растворителя за несколько сантиметров до нижнего слоя сорбента. При проточном методе собирают фракции растворителя отдельными порциями.

Проявление хроматограммы. По окончании процесса хроматографирования любым, кроме проточного, методом анализируемые вещества остаются на слое сорбента. Однако большинство определяемых соединений бесцветно, поэтому зоны хроматографируемых веществ остаются невидимыми. Их следует проявить, т.е. сделать видимыми. Поэтому пластинку по окончании процесса хроматографирования вынимают из камеры, растворитель испаряют и приступают к проявлению. Существует два способа проявления: химический и физический.

При химическом способе пластинку опрыскивают раствором какого-либо вещества, способного при взаимодействии с соединением, находящимся в слое, образовывать окрашенное соединение. Если невозможно подобрать вещество, которое давало бы окрашенные соединения со всеми компонентами анализируемой смеси, опрыскивание повторяют другим.раствором. Опрыскивание рекомендуется проводить из пульверизатора, дающего очень мелкое распыление. Само опрыскивание проводят в специальной камере. Обрабатываемую пластинку помещают на столике в стеклянный цилиндр. Торцевую часть колпака закрывают стеклом с отверстием для кончика пульверизатора, который устанавливают так, чтобы струя тумана была направ­лена под пластинку. При этом в камере образуется туман, постепенно контактирующий с поверхностью слоя сорбента, что способствует чёткому проявлению без нарушения целостности слоя сорбента. В отдельных случаях, когда взаимодействие проявляющего вещества с компонентами анализируемой смеси лучше проводить при повышенных температурах, пластинку после опрыскивания нагревают ИК лампой или в сушильном шкафу до требуемой температуры.

Иногда после опрыскивания пластинку приходится выдерживать в парах какого-либо вещества, например, аммиака. Тогда пластинку помещают в сосуд с насыщенными парами требуемого вещества. При отсутствии такой камеры можно опрыскивать непосредственно пластинку, установленную горизонтально и помещённую в вытяжной шкаф. Следует добиваться равномерного покрытия пластинки возможно более мелкими каплями при минимальном расходе реактива.

Наиболее простым способом химического проявления является обработка пластинки парами йода непосредственно после испарения растворителя. Для этого пластинку помещают в герметически закрывающийся сосуд, например, в эксикатор, содержащий кристаллы йода и некоторое количество воды. Через 10-15 мин пластинку вынимают и дают испариться избытку йода. Окрашенными оказываются только те места на слое сорбента, которые содержат компоненты анализируемой смеси. Особенно хорошо проявляются йодом непредельные соединения.

В ТСХ в качестве сорбента применяются вещества, стойкие в отношении крепких кислот, поэтому для проявления хроматограмм возможно применение концентрированной серной кислоты или её смеси с азотной, а также концентрированной фосфорной кислоты. При опрыскивании этими кислотами образуются тёмные пятна вследствие обугливания органических соединений. В результате химического проявления образуется хроматограмма, содержащая на светлом фоне сорбента окрашенные пятна. При полном разделении каждое пятно на пластинке соответствует определённому соединению.

Физический способ: некоторые вещества, содержащие хромофорные группы, способны под действием УФ излучения флюоресцировать. Этот метод особенно пригоден для обнаружения пятен веществ, содержащих фенольные группы, а также аминокислот и их производных. Если вещества сами не способны флюоресцировать, то при изготовлении сорбционных слоёв добавляют флюоресцирующий индикатор, обычно сульфид цинка. При просматривании пластинки в УФ свете на светящейся основе обнаруживаются тёмные пятна веществ. Их фиксируют, обводя контуры пятен карандашом прямо на слое или на кальке. Если флюоресцирующее вещество не было добавлено к сорбенту, то пластинку после испарения растворителя опрыскивают раствором флюоресцирующего вещества.

Для обнаружения пятен веществ, обладающих радиоактивным излучением, применяют метод радиоавтографии. После испарения растворителя со слоя к нему плотно прикладывается фоточувствительная пленка или бумага, выдерживается некоторое время, а затем проявляется. Время выдержки определяется чувствительностью фотоматериала и интенсивностью излучения. После проявления на плёнке или бумаге обнаруживаются чёрные пятна, соответствующие радиоактивным веществам.