Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Каждая пробирка или флакон должны иметь маркировку, соответствующую номеру
животного, от которого получена проба. Образцы крови до исследования хранят при 4 - 8°С не более 24 часов. Для более длительного хранения пробы должны быть заморожены при -20°С. Выделение геномной ДНК. В микроцентрифужную пробирку помещают 50 мкл крови и 250 мкл лизирующего буфера. Смесь инкубируют 1 час при 56°С. Дважды экстрагируют равным объемом смеси Фенол:хлороформ, третью экстракцию проводят равным объемом хлороформа. Центрифугируют 10 мин при 12000 g. Отбирают супернатант, добавляют к нему 2,5 М ацетат натрия, рН 5,2, до концентрации 0,25 М и два объема охлажденного 96% этанола. Раствор выдерживают 30-40 мин при -20°С. Центрифугируют 10 мин при комнатной температуре. Осадок промывают 600 мкл 70% этанола, центрифугируют 10 мин при 12000 g, подсушивают Мин и растворяют в стерильной деионизированной воде в объеме, равном половине Первоначального объема крови. Выделение геномной ДНК можно проводить любым другим методом, позволяющим Получить нуклеиновую кислоту, пригодную для амплификации в ПЦР. Полимеразная цепная реакция Выделенную ДНК амплифицируют в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: • р-рДНК 2-4 мкл • 10х буфер ПЦР 2,5 мкл • 2,5 mM MgCl2 5 мкл • 10 mMdNTP 0,75 мкл • праймеры по 1 мкл каждого • вода до 25 мкл • Taq-полимераза 1 ед. акт. Смесь набирают непосредственно перед амплификацией, прогревают 5 мин при 95°С, Добавляют Taq-полимеразу и наслаивают 20 мкл минерального масла для предотвращения Испарения. Проводят 25-30 циклов амплификации в режиме: • денатурация 30 с при 94°С; • отжиг - 30 с при 48-65°С (температура подбирается опытным путем для каждой пары праймеров); • синтез 90 с при 72°С. Если после 25-30 циклов реакции в пробе не обнаруживается специфический фрагмент (анализ электрофорезом в агаровом геле), то отбирают аликвоту 2-4 мкл и переносят в новую Пробирку, содержащую реакционную смесь с внутренними праймерами (так называемая «nestecb-ПЦР) и проводят еще 25-30 циклов амплификации в том же режиме. Такая Реамплификация позволяет увеличить как чувствительность, так и специфичность реакции. Электрофорез в геле агарозы. Анализ продуктов реакции проводят методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Рассчитанное количество порошка агарозы и отмеренный объем 50 mM буфера для электрофореза нагревают до полного растворения агарозы, остужают до 50-55°С, добавляют Бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл и заливают гель, в который немедленно Вставляют гребенку для получения в геле лунок для нанесения проб. Через 20-30 мин после Того, как застыла агароза, гель помещают в камеру для электрофореза, наливают 50 mM буфер Для электрофореза, наносят аликвоты реакционной смеси продуктов ПЦР, смешанные с Буфером для нанесения проб, и проводят электрофорез при напряжении 100 В, пока Бромфеноловый синий не пройдет 1,5-2 см от старта. Учет результатов реакции. Для идентификации специфического фрагмента используют стандартные маркеры - Наборы фрагментов ДНК известной длины. При просмотре геля в ультрафиолете присутствие Фрагмента определенного размера свидетельствует о наличии в пробе провирусной ДНК. Гематологический метод исследования Метод заключается в подсчете количества лейкоцитов в единице объема крови (1 Мкл) и качественной оценке лимфоидных элементов - лимфоцитов. Гематологическому исследованию подвергают животных, в сыворотке крови которых Серологическим методом (РИД, ИФА) обнаружены специфические антитела к ВЛКРС. Объектом гематологического исследования являются периферическая кровь, пунктаты Костного мозга, селезенки, лимфоузлов. Гематологические исследования позволяют выявлять больных животных, а также Проводить дифференциальную диагностику форм и стадий болезни. Кровь для гематологических исследований берут из яремной вены в пробирки с
|
|||||
Последнее изменение этой страницы: 2020-12-09; просмотров: 65; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.191.236.174 (0.005 с.) |