Базисные ядовые тесты, применяемые в коагулологии.

I. Тесты с активацией X фактора:

а) Зарубежные методики:

Тест с ядом цепочной гадюки Рассела (Vipere russile test, VRT). Змея обитает на территории Индии. Монополист в производстве яда фирма “Пентофарма”. Яд применяется в разведенной форме (dilut, DVVRT) для диагностики АФС.

б) Отечественные аналоги:

Тест с ядом среднеазиатской гадюки/гюрзы (Vipere lebetina). Лебетоксовый тест. Методика проведения теста проста: плазма, бедная тромбоцитами + рабочий раствор яда змеи инкубируются одну минуту при температуре 37°С + рабочий раствор хлорида кальция. Яд активирует X фактор. Рабочий раствор, имеющий активность на свежей плазме 20-25 секунд очень стабильный и может храниться в холодильнике несколько недель. В диагностике АФС применяют дилют с активностью 40-65 сек. После разведения кристаллов яда он должен созреть в течение суток. Тест диагностирует нарушения в системе гемостаза, начиная с X фактора. Чувствителен к снижению X, V, II, I, XIII факторов.

Применение:

1. Диагностика коагулопатий.

АПТВ	ПВ	Лебетоксовый тест	Причина нарушений
норма	удлинение	норма	VII
удлинение	норма	норма	XII, XI, IX, VIII
удлинение	удлинение	удлинение	X, V, II, I, XIII

2. Диагностика АФС.

3. Внутрилабораторный контроль правильности забора крови и соотношения раствора цитрата натрия и крови (учет гематокрита). Они очень чувствительны к передозировке цитрата натрия. Отвечают гипокоагуляцией. Часто бывает у больных с полиглобулией. Яды “плывут”/удлиняются на 3-6 секунд от контроля при нормальных других тестах. Эти методики очень стабильны. Не чувствительны к грязной посуде и повышению температуры. Желательно их выполнять в разных комнатах, т.к. они значимо ускоряют другие тесты при случайном попадании в посуду (АПТВ становится 25 сек, каолиновое 25 сек.).

4. В диагностике нарушения белковосинтетической функции печени. Т.к. свертывание под действием яда идет альтернативным путем, поэтому когда еще фибриноген и уровень белков в плазме крови еще в норме, а лебетоксовое время снижено или на нижней границе нормы. Дополнительное снижение уровня протеинов С и S является показанием к гепатопротективной терапии.

При покупке яда, необходимо требовать сертификат качества, т.к. производить яд могут только сертифицированные лаборатории. Вместо яда гадюки могут подсунуть яд кобры, который не обладает коагулирующим действием, а только нейропаралитическим. Важны условия забора яда. Дойка змей должна проводиться в период биологической активности – весной и летом, а не зимой. Между дойками должно быть выдержано время, т.к. при небольшом перерыве получают только слюну.

5. Лебетоксовое время свертывания удлиняется при лечении НАК параллельно с протромбиновым временем или даже раньше (дефицит II фактора).

II. Тесты с активацией II фактора:

а) Зарубежные методики:

- Тест с ядом эфы песчаной (Echis carinatus). Экариновый тест. Данный вид обитает в Африке.

- Тест с ядом австралийского кайпана.

б) Отечественные аналоги:

- Тест с ядом эфы песчаной из Средней Азии.

- Тест с ядом эфы многочашуйчатой. (Echus multiscvamosus carinatus). Эхитоксовый тест.

Чувствителен к снижению II, I, XIII факторов.

Применение:

1. Диагностика коагулопатий.

АПТВ	ПВ	Лебетоксовый тест	Эхитоксовый тест	Причина нарушений
удлинение	удлинение	удлинение	норма	X, V
удлинение	удлинение	удлинение	удлинено	X, V, II, I, XIII

2. Диагностика АФС.

Этот тест фосфолипиднечувствиетелен, в отличии от лебетоксового теста. Яд гюрзы и эфы это парные противовесные тесты.

3. В диагностике нарушения белковосинтетической функции печени. Рано дает гипокоагуляцию.

4. Тест не чувствителен к содержанию гепарина в плазме крови. По нему можно оценивать тромбогенный риск на фоне лечения гепарином – гиперкоагуляция в тесте.

5. Внутрилабораторный контроль правильности забора крови.

6. Прогноз ДВС синдрома.

При нормальном физиологическом свертывании из протромбина образуется a-тромбин. При активации протромбина ядом эфы образуется мейзотромбин. Он супер-наглый. Его активность в 100 раз выше активности a-тромбина. У людей без укуса его концентрация повышена только при катастрофическом свертывании по внешнему пути (краш-синдром, эмболия околоплодными водами). Этот тест чувствителен к предшествующему сосудистому свертыванию. По общим тестам норма, а эхитоксовый тест уже укорачивается. Является предвестником ДВС синдрома. В последней стадии ДВС синдрома он позже всех выходит из гиперкоагуляции. Получаются ножницы: раньше всех входит в гипер и позже всех выходит из нее. Если в процессе лечения по этому тесту гиперкоагуляция, то лечение неэффективно. Когда нормализовался, следовательно оборвался процесс тромбообразования. Когда он с другими тестами уходит в гипокоагуляцию, то это прогностически неблагоприятный признак – это терминальная стадия ДВС синдрома.

7. Отслеживает уровень фибриногена.

Мейзотромбин способен образовывать сгусток из заблокированного фибриногена - РФМК. Метод определения фибриногена гравиметрически по Рутберг показывает свободный фибриноген (тромбинпозитивный фибриноген). При образовании сгустка с применением яда эфы оценивается пул общего фибриногена (тромбинпозитивный и негативный фибриноген). С применением яда эфы количество фибриногена всегда больше. Если по Рутберг и с эфой фибриноген не определяется, значит его уже нет в плазме. Необходимо смотреть, какой фибриноген был изначально, до заболевания. Например, до ДВС синдрома с эфой он был 6 г/л, а после стал 2 г/л, то это уже мало. А если изначально 3 г/л, а после 2 г/л, то это еще хороший уровень.

8. Эхитоксовое время свертывания удлиняется при лечении НАК параллельно с протромбиновым временем или даже раньше (дефицит II фактора). Чем выше МНО, тем длиннее время. Зависимость не линейная.

III. Тесты с активацией I фактора:

а) Зарубежные методики:

- Тест с ядом гремучих змей (Bothrops atrox). Батроксобиновый тест.

- Тест с ядом щитомордника малазийского.

б) Отечественные аналоги:

- Тест с ядом среднеазиатского обыкновенного щитомордника (Agkist­rodon halys halys). Анцистродоновый тест или тест со щитомордником.

В яде этих змей имеется коагулаза – парциальный тромбин, который действует непосредственно на молекулу фибриногена. Чувствителен к снижению I, XIII факторов. Из этих тромбиноподобных экстрактов изготавливают лекарственные препараты антитромботического действия для в/в введения. Механизм действия основан на том, что яд переводит фибриноген в дезАфибрин-мономер, отщепляя от молекулы фибриногена только лишь фибринопептид А. Эти дезАфибрин-мономеры полимеризуются в ди- и тримеры, которые не стабилизируются XIII фактором и легко растворяются фибринолитической системой. У животных и людей плохо вырабатываются антитела на яд змей. Поэтому тяжело получить сыворотки от змеиных укусов. По этой же причине данные препараты долго циркулируют в организме и оказывают терапевтическое действие.

Если существует высокий риск тромбоза и нужно выполнять оперативное вмешательство, например опухоль, то вводят препарат актилазу и она разрушает фибриноген. Это лечебная дефибринация.

Применение:

1. Выявляет дефицит I и XIII в паре с тромбиновым временем свертывания. Выявляет дисфибриногенемию. Это заболевание очень редко. Встречается при мезенхимальных дисплазиях. Этот патологический процесс сопровождается патологией сосудистой стенки, тромбоцитопатией, болезнью Вилебранда, гипермобильностью суставов, птозом внутренних органов, аномалиями скелета и др.

Тромбиновое время	Анцистродоновое время	Причина нарушений
удлинение	удлинение	- увеличение ПДФ (нарушение полимеризации фибрина) при лечении фибринолитиками; - а/гипофибриногенемия; - дисфибриногенемия.
удлинение	норма	лечение гепаринами

2. Тест не чувствителен к содержанию гепарина в плазме крови. По нему можно оценивать тромбогенный риск на фоне лечения гепарином – гиперкоагуляция в тесте.

 

“ АНТИКОАГУЛЯНТЫ ”

Свертывающая и противосвертывающая (фибринолитическая и антикоагулянтная) системы весьма сбалансированы. При нерациональном лечении можно вывести эти системы из равновесия: при массивной гепаринотерапии истощается AT III, что приводит к тромбозам. При назначении НА возникают тромбозы при патологии в системе протеина С (быстрое снижение вместе с VIIф).

Классификация

1. Физиологические.

- система AT III,

- система протеина С,

- a₂ макроглобулин.

2. Патологические:

- волчаночный антикоагулянт,

- продукты деградации фибриногена ПДФг,  при ДВС- Sd.

- продукты деградации фибрина ПДФ.               

AT III

Циркулирует в кровотоке в большом избытке. Он малоактивен. Прогрессивнодействующийбез гепарина, быстродействующий в связи с гепарином. Инактивирует Xa, IIa – основные, IXф, XIa – дополнительные. Если он в кровотоке в комплексе с гепарином, то его активность увеличивается в 1000-100000 раз. Гепарин – сульфатированный гликополисахарид. Он сам не обладает а/коагулянтной активностью. (?) (З.С. Баркаган). Периваскулярное пространство богато тучными клетками, содержащими гепарин, но он участвует в воспалительных процессах. Когда исходно мало AT III и дают гепарин, то он быстро снижает содержание этого антикоагулянта и возникает политромботический синдром. Возмещают его недостаток трансфузией СЗП или концентратом AT III – препарат кибернин. Гепарин вызываетостеопороз при длительном применении, до патологических переломов, особенно у женщин и беременных. Низкомолекулярные гепарины (фрагмин, клексан, фраксипарин) не обладают таким побочным действием. Плацента беременной женщины не пропускает мелкие молекулы, а крупные пропускает. Поэтому гепарин можно назначать беременным.

 

Фактор XIa          Фактор IXa

Фактор XIIa                                                                 Фактор VIIa

Комплемент                                                                                 Фактор Xa

	активация

ATIII              ATIIIa

 

Калликреин                                  Гепарин                                 Плазмин

угнетение

Тромбин

 

 

Фактор VIIa                                          Фактор VIIa

Протеин С

 

 

Протеин С

Имеется связь с системой AT III.

Составные компоненты:

1. Протеин С.   Vit -К зависимые (синтез в печени);

2. Протеин S.      

3. Тромбомодулин (вырабатывается в эндотелии, связывает тромбин и активирует протеин С).

НА подавляют синтез протеина С. Протеин С активируется под действием комплекса тромбин-тромбомодулин в присутствии протеина S (как кофактора протеина С). В данном случае тромбин сам себе “могильщик” при взаимодействии с тромбомодулином он теряет свертывающую активность, но способен активировать протеин С, который инактивирует Va, VIIIa (т.н. акселераторы). Опыт: в кровь кролика in vitro добавить тромбин произойдет свертывание, если добавить in vivo свертывания не будет.

Частая врожденная причина тромбофилий – аномалия Лейден, при которой происходит синтез аномального протеина С. Развивается склонность к тромбозам. Патология протеина С и гена Лейден очень высока (1-15%) – это резистентность Vф к протеину С. Для дифференцировки ДВС-Sd от гиперкоагуляционного синдрома необходимо определить уровень протеина С и AT III. Сейчас Япония синтезировала препарат, содержащий AT III + протеин С + тромбомодулин. Место синтеза AT III гепатоцит,? макрофаг,? эндотелий.

Фибринолиз