Рецепторы и лиганды активации тромбоцитов

Фазы ответа	Лиганды, агонисты, субстраты	Основные рецепторы
Инициирование   Прикрепление      и адгезия     тромбоцитов	Фактор фон  Виллебранда Коллаген Фибриноген/фибрин  Фибронектин Ламинин	ГП Ib/IX/V  ГП VI, a 2 b 1 a IIb b 3 a5 b1 a 6 b 1
Распространение        Активация       Тромбоцитов        Агрегация	Тромбин АДФ Тромбоксан А2 Адреналин Фибриноген Фактор фон  Виллебранда Фибронектин	PAR1, PAR4 ГП Ib/IX/V P2Y1,  P2Y12 TP   a 2A aIIb b3 aIIb b3
Стабилизация	P - селектин CD 40 лиганд	PSGL -1 a IIb b 3
Ингибирование	Простациклин (PGI 2) Оксид азота (NO) АДФ- аза	IP

1.3.4.   Адгезия тромбоцитов к субэндотелию.                                          

Известны две основные стадии адгезии тромбоцитов: 

1. стадия контакта или прикрепления, 

2. стадия распластывания. 

Прикрепление тромбоцитов к поврежденной стенке сосуда обеспечивает фактор фон Виллебранда (VWF).

 

1.3.4.1. Фактор фон Виллебранда: структура и свойства

Фактор фон Виллебранда(VWF), маркер повреждения эндотелия, синтезируется в клетках эндотелия и в предшественниках тромбоцитов - мегакариоцитах и запасается в Вейбела-Пэйлейда (Weibel-Palade) тельцах эндотелиальных клеток и a-гранулах тромбоцитов.

Зрелый фактор фон Виллебранда состоит из мультимеров, соединенных дисульфидными связями, с очень высокой молекулярной массой (20000кДа и более).Основа структуры фактора фон Виллебранда – димер, который состоит из двух субъединиц, соединенных СOOH-концами, и служит блоком для строительства большого мультимера. Каждая субъединица фактор фон Виллебранда состоит из модулей -доменов (D’-D3-A1-A2-A3-D4-B-C1-C2) с определенными функциями. Именно поэтому фактор фон Виллебранда называют модульным белком (Рис 4).

 

Домены- функциональные единицы, устойчивые к протеолизу, соединяются участками, чувствительными к протеолизу. В молекуле фактора фон Виллебранда обнаружены домены, ответственные за связывание фактора VIII свертывания крови, рецепторов тромбоцитов - гликопротеиновых трансмембранных комплексов: ГП Ib/IX/V и интегрина aIIbb3 (ГП IIb/IIIа ), а также гепарина и коллагена.

Последовательность типа С1 отвечает за связывание с интегрином aIIb/b3. В его структуре обнаружен реактивный участок молекулы - уникальный трипептид с последовательностью Арг1744-Гли1745-Асп1746 (RGD), который отвечает за связывание с интегринами клеток (Рис 4). Аналогичный пептид содержится в структуре многих адгезивныхбелков - фибриногена, фибронектина, тромбоспондина, витронектина и других (Таблица 3).

Участки связывания VWF с ГП Ib формируются только после конформационных изменений в структуре А1 дисульфидной петли после иммобилизации фон Виллебранда фактора на коллагене субэндотелия. Нативная молекула растворимого VWF плазмы не способна связывать рецептор тромбоцитов ГП Ib.

На первой стадии адгезии (стадии контакта) происходит связывание фон Виллебранда фактора с ГП Ib комплекса ГП Ib/IX/V(Рис 5).

Рассмотрим подробнее реакции эндотелия на повреждение. Из телец Вейбела-Пэлейда эндотелиальных клеток освобождается мультимер – фон Виллебранда фактор, который связывает коллагены субэндотелия и рецептор тромбоцитов - гликопротеин Ib a (ГП Ib a) и обеспечивает мобилизацию и активацию тромбоцитов (Рис 4,5).

 

Фон Виллебранда фактор через два типа А доменов (А1 и А3) связывается с коллагенами субэндотелия, которые обнажаются при повреждении сосуда. А3 домен обеспечивает достаточно прочную иммобилизацию фон Виллебранда фактора на коллагенах типа I или типа III (субэндотелия), а домен А1 отвечает за связывание фактора с коллагеном типа VI. Кроме коллагенов другие компоненты субэндотелиального матрикса могут участвовать в связывании и иммобилизации фон Виллебранда фактора. Иммобилизованный на коллагене субэндотелия VWF через участок А1 домена взаимодействует с a-цепями ГП Ib и “привязывает” клетки, выполняя функции “мостика” между коллагеном и тромбоцитами (Рис 5).

Итак, фон Виллебранда фактор, иммобилизованный на коллагене субэндотелия, связывается с a цепями ГП Ib и “привязывает” клетки, выполняя функции “мостика” между коллагеном и тромбоцитами (Рис 5).

 

1.3.4.2. ГП Ib–рецептор фон Виллебранда фактора и тромбина

ГП Ib - интегрин, существует на поверхности интактных тромбоцитов в комплексе с ГП IX и ГПV (ГП Ib/IX/V) (Рис 6). ГП Ib состоит из двух субъединиц: a-(130 kDa) и b-(25 kDa), связанных дисульфидным мостиком, и стабилизирован на поверхности интактных тромбоцитов не ковалентной связью с двумя цепями ГП IX(22 kDa) и одной цепью ГПV(82 kDa) (в отношении 2:2:2:1). Все компоненты комплекса относятся к типу I гликопротеинов, связанных с мембраной, имеют в структуре  повторы участков, богатых лейцином, и N- и С-концевые петлевидные фланкирующие последовательности.

ГП Ib a - основная субъединица комплекса ГП Ib/IX/V, связывающая лиганды.ГП Ib a содержит в N-концевой последовательности (1-282ао) перекрывающиеся, но разные участки связывания VWF, Р-селектина, лейкоцитарного интегрина Мас-1(aМ/ b2, CD11b/CD18), высокомолекулярного кининогена, а также протеиназ - тромбина и фактора XIa контактной фазы свертывания крови.

Тромбин, связываясь с ГП Ib a двумя участками своего центра узнавания, может служить мостиком между ГП Ib a одного и того же тромбоцита или близлежащих клеток.  

 

1.3.4.3.Активация тромбоцитов фактором фон Виллебранда

Фактор фон Виллебранда, взаимодействуя с рецептором — ГП Ib (комплекса ГП Ib/IX/V), активирует клетки, стимулирует следующие реакции:

1) экспонирование на мембране интегрина aIIb/ b3,

2) распластывание тромбоцита,

3) секрецию агонистов агрегации –АДФ и тромбоксана А₂ (ТХА₂) (Рис 6).

Механизм передачи сигнала через ГП Ib внутрь клетки осуществляется двумя путями.

1 - через прямое взаимодействие цитоплазматического домена ГП Iba с белками цитоскелета (участвующими в передаче сигнала, такими как филамин и адапторный белок 14-3-3z). Эти белки связаны с кальмодулином, а также ассоциированы с Src киназами и PI3-киназами. Фосфорилирование этих белков цитоскелета происходит, в частности в результате связывания фон Виллебранда фактора с ГП Iba, что вызывает повышение концентрации внутриклеточного кальция ([Ca ²⁺]_i ), изменение формы тромбоцита, его распластывание, активацию и экспонирование на поверхности клетки второго рецептора VWF -интегрина aIIb/b3 (ГП IIb/IIIа по устаревшей номенклатуре).

2 - через ассоциацию комплекса ГП Ib/IX/V с двумя ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activatory motifs) - содержащими белками (FcgRIIa и FcRg). В результате это взаимодействие ведет к фосфорилированию ITAM тирозина семейством syk киназ, активации фосфолипазы Сg (PLC), протеинкиназы C (PKC) и повышению концентрации внутриклеточного кальция.

Оба пути передачи сигнала через рецептор ГП Ib ведут к  активации тромбоцита, освобождению агонистов агрегации тромбоцитов – АДФ, тромбоксана А₂ (ТХА₂), и экспонированию на поверхности клетки интегрина aIIb/ b3 - рецептора фибриногена и VWF. Связывание интегрина aIIb/ b3 с лигандами индуцирует активацию тромбоцита по механизму снаружи-внутрь (outside- in).

Итак, интегрин aIIb/ b3 служит рецептором как фактора фон Виллебранда, так и фибриногена (Рис 5, 6).

Большая часть интегринов aIIb/b3 на активированных тромбоцитах оккупируется фибриногеном, поскольку в плазме человека концентрация фибриногена на несколько порядков выше (около 9mM), чем фактора фон Виллебранда (около 1nM). При недостаточности фибриногена или его отсутствии у пациентов с афибриногенемией фактор фон Виллебранда может поддерживать агрегацию тромбоцитов. Фактор фон Виллебранда отвечает за формирование достаточно стабильных агрегатов тромбоцитов в поврежденных сосудах с высоким напряжением сдвига и скоростью сдвига, как например в артериолах, тогда как один фибриноген не способен обеспечить в них агрегацию. О конкуренции фактора фон Виллебранда и фибриногена за связывание с экспонированным интегрином aIIb/b3 свидетельствует тот факт, что начальная скорость агрегации тромбоцитов выше в отсутствии фибриногена.

 

1.3.4.4. Интегрины– рецепторы адгезивных белков

Интегрин aIIb/b3 (ГП IIb/IIIа) – катионзависимый гетеродимерный комплекс - состоит из двух мембранных гликопротеинов I типа– субединиц aIIb и b3.

Семейство интегринов обеспечивает связывание клеток с адгезивными белками сосудистой стенки — фактором фон Виллебранда, коллагеном, фибронектином, ламинином, тромбоспондином и фибриногеном плазмы крови (Таблица 3). Из всех адгезивных белков только (!!!) фактор фон Виллебранда, связывая ГП Ib в комплексе ГП Ib/IX/V, обеспечивает начальное прикрепление тромбоцитов к поврежденному субэндотелию в сосудах с высокой скоростью сдвига. Интегрины работают как рецепторные белки и регулируют клеточные функции.

 

Таблица 3                                                                                                                       

Адгезивные белки, их рецепторы и лиганды в образовании

Тромбоцитарных тромбов

 

Адгезивные белки и субстраты	Рецепторы	Лиганды адгезивных белков
Фактор фон  Виллебранда	ГП Ib a IIb b 3	Фактор VIII коллаген(I-VI типы) фибрин гликозаминогликаны
Коллаген	ГП VI  a 2 b 1	фактор фон  Виллебранда фибриноген  фибронектин тромбоспондин
Фибриноген/ Фибрин	aIIb b3 av b1 av b2 av b3	тромбин фактор XIII плазминоген t- PA фибронектин коллаген гепарин
Фибронектин	aIIb b3 a5 b1	коллаген фибрин фактор XIII гепарин актин тромбоспондин

 

Вслед за адгезией тромбоцитов к поврежденному сосуду с помощью мостика - фактора фон Виллебранда, происходит прямое взаимодействие тромбоцитов с коллагеном субэндотелия сначала через рецептор ГП VI, а затем через интегрин a2b1, что обеспечивает устойчивую адгезию, активацию и агрегацию клеток (Рис. 5).  

Коллаген взаимодействует с рецептором ГП VI тромбоцита, который фосфорилируется src семейством тирозинкиназ. Передача сигнала внутрь клетки ведет к активации фосфолипазы С (ФЛС)g, освобождению внутриклеточного посредника – внутриклеточного кальция ([ Са ²⁺ ]i), и агониста агрегации - АДФ. В результате активации рецептора ГП VI происходит конформационная перестройка второго рецептора коллагена - интегрина a2b1 (ГП Ia-IIa) в состояние высокого сродства к коллагену. Эта реакция обеспечивает стабилизацию адгезии, распластывание тромбоцитов, их активацию и последующее экспонирование на поверхность тромбоцита интегрина aIIbb3 (Рис 5). Интегрин aIIbb3 связывает фибриноген и через этот мостик рекрутирует еще не адгезированные, но активированные тромбоциты. Фибриноген служит агонистом интегрина aIIb/b3 и индуцирует активацию клеток по механизму снаружи-внутрь.

Таким образом, на начальной стадии адгезии тромбоцитов к субэндотелию имеет место связывание фон Виллебранда фактора с ГП Ib комплекса ГП Ib/IX/V на тромбоцитах, активация клеток. Коллаген субэндотелия предоставляет не только участок узнавания и прикрепления фон Виллебранда фактора к субэндотелию, но и активно взаимодействует со своими рецепторами на тромбоцитах - ГП VI и интегрином a 2 b 1, и активирует адгезию и агрегацию клеток. На стадии распластывания происходит взаимодействие домена фон Виллебранда фактора, содержащего пептид RGD, с интегрином a IIb b 3. В последнюю стадию включаются только активированные тромбоциты, так как только после активации клеток происходит экспонирование интегрина a IIb b 3 на мембрану клетки и его связывание с адгезивными белками.

При адгезии тромбоцита через ГП Ib или aIIb/ b3 к VWF, иммобилизованному на коллагене субэндотелия генерируются разные кальциевые сигналы, кооперативно регулирующие поведение тромбоцита. Одиночные кальциевые спайки, возникающие при активации ГПIb, вызывают обратимую активацию тромбоцита, экспонирование на поверхность интегрина aIIb/ b3 и непрочное прикрепление клетки к субстрату. Последующие устойчивые кальциевые осцилляции, возникающие при активации aIIb/ b3 адгезивными белками, обесп ечивают прочную адгезию.

Итак, за адгезией клеток следует стадия агрегации активированных тромбоцитов. Склеивание клеток осуществляет фибриноген, рецептором которого на тромбоцитах служит интегрин a IIb b 3. Он образует мостики между клетками. На поверхности каждого активированного тромбоцита может находится от 40000 до 80000 копий рецептора - интегрина a IIb b 3 и поэтому образуются очень большие агрегаты клеток в участке активации тромбоцитов. Но агрегаты не достаточно прочны.

В стабилизацию агрегатов вовлекаются другие адгезивные белки: тромбоспондин и фибронектин (Рис 5).

Тромбоспондин-1 освобождается из гранул тромбоцитов.  Подобно фактору фон Виллебранда тромбоспондин является модульным гликопротеидом. Молекула его состоит из трех мономеров. В структуре тромбоспондина идентифицированы домены, отвечающие за связывание фибриногена, коллагена, гепарина, фибронектина и клеток  посредством реактивного пептида RGD. Основная функция тромбоспондина в гемостазе - стабилизировать связывание клеток с фибриногеном. Тромбоспондин превращает обратимые комплексы в необратимые. Его рецепторы на тромбоцитах- ГП IV(С D 36) и интегрин a IIb b 3 (ГП II b /IIIа).Тромбоспондин связывается с фибриногеном и с рецептором на тромбоцитах.

Фибронектин – основной компонент соединительнотканного матрикса, имеет мультидоменную структуру. Его домены отвечают за связывание с коллагеном, фибрином, фактором XIII свертывания крови,гепарином, актином, тромбоспондином и другими лигандами (Таблица 3). Фибронектин относится к третьему типу белков, связывающих клетки, поскольку выполняет роль и структурного матрикса и белка, связывающего клетки с матриксом. Синтезируются два варианта фибронектина: в мегакариоцитах, предшественниках тромбоцитов, плазменный фибронектин, лишенный последовательности типа III и свободно циркулирующий в кровотоке; в фибробластах синтезируется фибронектин, содержащий блок типа III, связывающий клетки. Фибронектин легко полимеризуется и образует сеть нерастворимых фибрилл матрикса.  

Таким образом, в адгезии и агрегации тромбоцитов участвуют адгезивные белки, имеющие рецепторы-интегрины на клетках и множество лигандов, обеспечивающих связывание клеток с компонентами внеклеточного матрикса стенки сосуда и белками крови. Адгезия тромбоцитов к поврежденному участку сосуда обеспечивается лигандами, взаимодействующими с активированным и экспонированным интегрином aIIb/b3: самим фон Виллебранда фактором, фибриногеном, а также фибронектином, тромбоспондином и другими лигандами, необходимыми для обеспечения стабильных тромбоцитарных агрегатов.