Глава 1. Структурно-функциональные особенности первичного гемостаза

Глава 1. Структурно-функциональные особенности первичного гемостаза

 

1.1. Гемостаз – физиологическая реакция организма.                  

Гемостаз - физиологический процесс, включает ряд реакций, которые обеспечивают:

• быструю остановку кровотечения при повреждении сосудистой стенки,
• восстановление целостности кровеносных сосудов и
• утилизацию сгустков крови,
• сохранение крови в жидком состоянии в сосудистом русле.

 

Свертывание крови – составная часть гемостаза, служит одной из основных защитных реакций организма при угрозе кровопотери.  

  В реакциях гемостаза участвует три основные системы: 

· сосудистая,

· свертывающая,

·  противосвертывающая система.

 Реактивность сосудистой системы  определяется состоянием клеток и компонентов стенки сосуда. За функции свертывающей системы отвечают клетки крови, прежде всего тромбоциты (кровяные пластинки), и плазменные факторы свертывания. П ротивосвертывающая система объединяет регуляторы свертывания, к важнейшим из которых относят: ингибиторы активных факторов свертывания и их кофакторы; активаторы и ингибиторы фибринолиза (механизма лизиса сгустка фибрина); компоненты антикоагулянтной системы протеина С.

Патология гемостаза проявляется в тромбозах, прижизненном свертывании крови в сосудах, и в геморрагиях, кровоточивости. При ряде патологий, например синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания, наблюдают сочетание обеих видов нарушений гемостаза - микротромбоз и кровоточивость. 

 

Итак, фон Виллебранда фактор, иммобилизованный на коллагене субэндотелия, связывается с a цепями ГП Ib и “привязывает” клетки, выполняя функции “мостика” между коллагеном и тромбоцитами (Рис 5).

 

1.3.4.2. ГП Ib–рецептор фон Виллебранда фактора и тромбина

ГП Ib - интегрин, существует на поверхности интактных тромбоцитов в комплексе с ГП IX и ГПV (ГП Ib/IX/V) (Рис 6). ГП Ib состоит из двух субъединиц: a-(130 kDa) и b-(25 kDa), связанных дисульфидным мостиком, и стабилизирован на поверхности интактных тромбоцитов не ковалентной связью с двумя цепями ГП IX(22 kDa) и одной цепью ГПV(82 kDa) (в отношении 2:2:2:1). Все компоненты комплекса относятся к типу I гликопротеинов, связанных с мембраной, имеют в структуре  повторы участков, богатых лейцином, и N- и С-концевые петлевидные фланкирующие последовательности.

ГП Ib a - основная субъединица комплекса ГП Ib/IX/V, связывающая лиганды.ГП Ib a содержит в N-концевой последовательности (1-282ао) перекрывающиеся, но разные участки связывания VWF, Р-селектина, лейкоцитарного интегрина Мас-1(aМ/ b2, CD11b/CD18), высокомолекулярного кининогена, а также протеиназ - тромбина и фактора XIa контактной фазы свертывания крови.

Тромбин, связываясь с ГП Ib a двумя участками своего центра узнавания, может служить мостиком между ГП Ib a одного и того же тромбоцита или близлежащих клеток.  

 

1.3.4.3.Активация тромбоцитов фактором фон Виллебранда

Фактор фон Виллебранда, взаимодействуя с рецептором — ГП Ib (комплекса ГП Ib/IX/V), активирует клетки, стимулирует следующие реакции:

1) экспонирование на мембране интегрина aIIb/ b3,

2) распластывание тромбоцита,

3) секрецию агонистов агрегации –АДФ и тромбоксана А₂ (ТХА₂) (Рис 6).

Механизм передачи сигнала через ГП Ib внутрь клетки осуществляется двумя путями.

1 - через прямое взаимодействие цитоплазматического домена ГП Iba с белками цитоскелета (участвующими в передаче сигнала, такими как филамин и адапторный белок 14-3-3z). Эти белки связаны с кальмодулином, а также ассоциированы с Src киназами и PI3-киназами. Фосфорилирование этих белков цитоскелета происходит, в частности в результате связывания фон Виллебранда фактора с ГП Iba, что вызывает повышение концентрации внутриклеточного кальция ([Ca ²⁺]_i ), изменение формы тромбоцита, его распластывание, активацию и экспонирование на поверхности клетки второго рецептора VWF -интегрина aIIb/b3 (ГП IIb/IIIа по устаревшей номенклатуре).

2 - через ассоциацию комплекса ГП Ib/IX/V с двумя ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activatory motifs) - содержащими белками (FcgRIIa и FcRg). В результате это взаимодействие ведет к фосфорилированию ITAM тирозина семейством syk киназ, активации фосфолипазы Сg (PLC), протеинкиназы C (PKC) и повышению концентрации внутриклеточного кальция.

Оба пути передачи сигнала через рецептор ГП Ib ведут к  активации тромбоцита, освобождению агонистов агрегации тромбоцитов – АДФ, тромбоксана А₂ (ТХА₂), и экспонированию на поверхности клетки интегрина aIIb/ b3 - рецептора фибриногена и VWF. Связывание интегрина aIIb/ b3 с лигандами индуцирует активацию тромбоцита по механизму снаружи-внутрь (outside- in).

Итак, интегрин aIIb/ b3 служит рецептором как фактора фон Виллебранда, так и фибриногена (Рис 5, 6).

Большая часть интегринов aIIb/b3 на активированных тромбоцитах оккупируется фибриногеном, поскольку в плазме человека концентрация фибриногена на несколько порядков выше (около 9mM), чем фактора фон Виллебранда (около 1nM). При недостаточности фибриногена или его отсутствии у пациентов с афибриногенемией фактор фон Виллебранда может поддерживать агрегацию тромбоцитов. Фактор фон Виллебранда отвечает за формирование достаточно стабильных агрегатов тромбоцитов в поврежденных сосудах с высоким напряжением сдвига и скоростью сдвига, как например в артериолах, тогда как один фибриноген не способен обеспечить в них агрегацию. О конкуренции фактора фон Виллебранда и фибриногена за связывание с экспонированным интегрином aIIb/b3 свидетельствует тот факт, что начальная скорость агрегации тромбоцитов выше в отсутствии фибриногена.

 

1.3.4.4. Интегрины– рецепторы адгезивных белков

Интегрин aIIb/b3 (ГП IIb/IIIа) – катионзависимый гетеродимерный комплекс - состоит из двух мембранных гликопротеинов I типа– субединиц aIIb и b3.

Семейство интегринов обеспечивает связывание клеток с адгезивными белками сосудистой стенки — фактором фон Виллебранда, коллагеном, фибронектином, ламинином, тромбоспондином и фибриногеном плазмы крови (Таблица 3). Из всех адгезивных белков только (!!!) фактор фон Виллебранда, связывая ГП Ib в комплексе ГП Ib/IX/V, обеспечивает начальное прикрепление тромбоцитов к поврежденному субэндотелию в сосудах с высокой скоростью сдвига. Интегрины работают как рецепторные белки и регулируют клеточные функции.

 

Таблица 3                                                                                                                       

Адгезивные белки, их рецепторы и лиганды в образовании

Тромбоцитарных тромбов

 

Адгезивные белки и субстраты	Рецепторы	Лиганды адгезивных белков
Фактор фон  Виллебранда	ГП Ib a IIb b 3	Фактор VIII коллаген(I-VI типы) фибрин гликозаминогликаны
Коллаген	ГП VI  a 2 b 1	фактор фон  Виллебранда фибриноген  фибронектин тромбоспондин
Фибриноген/ Фибрин	aIIb b3 av b1 av b2 av b3	тромбин фактор XIII плазминоген t- PA фибронектин коллаген гепарин
Фибронектин	aIIb b3 a5 b1	коллаген фибрин фактор XIII гепарин актин тромбоспондин

 

Вслед за адгезией тромбоцитов к поврежденному сосуду с помощью мостика - фактора фон Виллебранда, происходит прямое взаимодействие тромбоцитов с коллагеном субэндотелия сначала через рецептор ГП VI, а затем через интегрин a2b1, что обеспечивает устойчивую адгезию, активацию и агрегацию клеток (Рис. 5).  

Коллаген взаимодействует с рецептором ГП VI тромбоцита, который фосфорилируется src семейством тирозинкиназ. Передача сигнала внутрь клетки ведет к активации фосфолипазы С (ФЛС)g, освобождению внутриклеточного посредника – внутриклеточного кальция ([ Са ²⁺ ]i), и агониста агрегации - АДФ. В результате активации рецептора ГП VI происходит конформационная перестройка второго рецептора коллагена - интегрина a2b1 (ГП Ia-IIa) в состояние высокого сродства к коллагену. Эта реакция обеспечивает стабилизацию адгезии, распластывание тромбоцитов, их активацию и последующее экспонирование на поверхность тромбоцита интегрина aIIbb3 (Рис 5). Интегрин aIIbb3 связывает фибриноген и через этот мостик рекрутирует еще не адгезированные, но активированные тромбоциты. Фибриноген служит агонистом интегрина aIIb/b3 и индуцирует активацию клеток по механизму снаружи-внутрь.

Таким образом, на начальной стадии адгезии тромбоцитов к субэндотелию имеет место связывание фон Виллебранда фактора с ГП Ib комплекса ГП Ib/IX/V на тромбоцитах, активация клеток. Коллаген субэндотелия предоставляет не только участок узнавания и прикрепления фон Виллебранда фактора к субэндотелию, но и активно взаимодействует со своими рецепторами на тромбоцитах - ГП VI и интегрином a 2 b 1, и активирует адгезию и агрегацию клеток. На стадии распластывания происходит взаимодействие домена фон Виллебранда фактора, содержащего пептид RGD, с интегрином a IIb b 3. В последнюю стадию включаются только активированные тромбоциты, так как только после активации клеток происходит экспонирование интегрина a IIb b 3 на мембрану клетки и его связывание с адгезивными белками.

При адгезии тромбоцита через ГП Ib или aIIb/ b3 к VWF, иммобилизованному на коллагене субэндотелия генерируются разные кальциевые сигналы, кооперативно регулирующие поведение тромбоцита. Одиночные кальциевые спайки, возникающие при активации ГПIb, вызывают обратимую активацию тромбоцита, экспонирование на поверхность интегрина aIIb/ b3 и непрочное прикрепление клетки к субстрату. Последующие устойчивые кальциевые осцилляции, возникающие при активации aIIb/ b3 адгезивными белками, обесп ечивают прочную адгезию.

Итак, за адгезией клеток следует стадия агрегации активированных тромбоцитов. Склеивание клеток осуществляет фибриноген, рецептором которого на тромбоцитах служит интегрин a IIb b 3. Он образует мостики между клетками. На поверхности каждого активированного тромбоцита может находится от 40000 до 80000 копий рецептора - интегрина a IIb b 3 и поэтому образуются очень большие агрегаты клеток в участке активации тромбоцитов. Но агрегаты не достаточно прочны.

В стабилизацию агрегатов вовлекаются другие адгезивные белки: тромбоспондин и фибронектин (Рис 5).

Тромбоспондин-1 освобождается из гранул тромбоцитов.  Подобно фактору фон Виллебранда тромбоспондин является модульным гликопротеидом. Молекула его состоит из трех мономеров. В структуре тромбоспондина идентифицированы домены, отвечающие за связывание фибриногена, коллагена, гепарина, фибронектина и клеток  посредством реактивного пептида RGD. Основная функция тромбоспондина в гемостазе - стабилизировать связывание клеток с фибриногеном. Тромбоспондин превращает обратимые комплексы в необратимые. Его рецепторы на тромбоцитах- ГП IV(С D 36) и интегрин a IIb b 3 (ГП II b /IIIа).Тромбоспондин связывается с фибриногеном и с рецептором на тромбоцитах.

Фибронектин – основной компонент соединительнотканного матрикса, имеет мультидоменную структуру. Его домены отвечают за связывание с коллагеном, фибрином, фактором XIII свертывания крови,гепарином, актином, тромбоспондином и другими лигандами (Таблица 3). Фибронектин относится к третьему типу белков, связывающих клетки, поскольку выполняет роль и структурного матрикса и белка, связывающего клетки с матриксом. Синтезируются два варианта фибронектина: в мегакариоцитах, предшественниках тромбоцитов, плазменный фибронектин, лишенный последовательности типа III и свободно циркулирующий в кровотоке; в фибробластах синтезируется фибронектин, содержащий блок типа III, связывающий клетки. Фибронектин легко полимеризуется и образует сеть нерастворимых фибрилл матрикса.  

Таким образом, в адгезии и агрегации тромбоцитов участвуют адгезивные белки, имеющие рецепторы-интегрины на клетках и множество лигандов, обеспечивающих связывание клеток с компонентами внеклеточного матрикса стенки сосуда и белками крови. Адгезия тромбоцитов к поврежденному участку сосуда обеспечивается лигандами, взаимодействующими с активированным и экспонированным интегрином aIIb/b3: самим фон Виллебранда фактором, фибриногеном, а также фибронектином, тромбоспондином и другими лигандами, необходимыми для обеспечения стабильных тромбоцитарных агрегатов.

 

Морфология тромбоцитов

Тромбоциты, син.кровяные пластинки, – форменные элементы крови, небольшие (0,5-3,0мкм), дисковидные, безъядерные клетки (РИС 7), образуются из цитоплазмы крупных (2—50мкм) костномозговых клеток– мегакариоцитов.

Время жизни тромбоцитов 7-10 дней.

  Тромбоциты содержат множество гранул: α- гранулы, плотные гранулы, лизосомы, а так же органеллы: митохондрии, аппарат Гольджи.  Цитоскелет тромбоцита отвечает за изменение формы клетки, секрецию и ретракцию сгустка. Он формируется субмембранными филаментами актина, пучками микротрубочек, а также плотной тубулярной системой, которая образуется из эндоплазматического ретикулума мегакариоцита, и системой открытых каналов, так называемой открытой канальцевой или каналикулярной системой.    Клетки секретируют содержимое гранул через систему открытых каналов, которые сообщаются друг с другом и внешней средой и создают широкую поверхность для экзоцитоза и для взаимодействия мембранных рецепторов с агонистами. При связывании агониста, называемого индуктором, с рецептором на мембране клетки происходит активация тромбоцитов. 

Активация тромбоцитов АДФ

АДФ, освобождающийся из активированных клеток (плотных гранул тромбоцитов), взаимодействует со специфическими пуриновыми рецепторами на тромбоцитах и может вызывать обратимую и необратимую агрегацию в зависимости от концентрации агониста (Рис 11).

РИС 11

 

АДФ связывает два основных пуриновых рецептора на тромбоцитах - P2Y₁ и P2Y _12.

Итак, при действии небольших концентраций АДФ происходит обратимая агрегация, которая ведет к изменению формы клеток и экспонированию на поверхность интегринов aIIb/b3, связывающих фибриноген.

Необратимая агрегация, вызываемая более высокими концентрациями АДФ, приводит к реакции высвобождения. Эта реакция обеспечивается взаимодействием АДФ с другим членом семейства пуриновых рецепторов- P2Y ₁₂ (называемым также P2Y _adр.), связанным с белком Gi. Активация рецептора P2Y ₁₂ отвечает за ингибирование аденилатциклазы, снижение цАМФ и, как следствие, продолжительную агрегацию и секрецию (Рис11).       

Активация P2Y1 стимулирует первые этапы образования тромба, а активация P2Y12 способствует устойчивой активации тромбоцитов необходимой для образования стабильных тромбов.

Рецептор Р2Y₁₂ служит мишенью антитромботических лекарств, тинопиридинов (тиклопидина и клопидогреля) — сильных и специфических ингибиторов АДФ-вызванной агрегации тромбоцитов.

 

       Исходя из выше изложенного становится понятным, почему именно комбинационная терапия аспирином - блокатором циклооксигеназы тромбоцитов, препятствующим образованию ТХА2 (освобождаемого тромбином и другими сильными индукторами агрегации), и тиклопидином - блокирующим АДФ-вызванную агрегацию, является более результативной, чем монотерапия, для предотвращения тромбообразования при повреждении эндотелия (например, при атеротромбозе). Эти данные подтверждают критическую роль тромбоцитов в провокации тромбообразования.

ВАЖНО

·  Гемостатический баланс поддерживается синтезом в эндотелии протромботических и антитромботических компонентов системы свертывания крови. Гемостаз начинается с повреждения эндотелия, его активации, обнажения  субэндотелия, экспонирования на поверхность целого ряда рецепторов, адгезивных молекул, активаторов и ингибиторов гемостаза и сопряженных процессов.

· Первичный гемостаз - тромбоцитарно-сосудистый, многостадийный процесс, включает фазы: инициирования (прикрепление тромбоцитов к субэндотелию и их адгезию),   распространения (активация и агрегация тромбоцитов под действием специфических агонистов), стабилизации и ингибирования.

· На начальной стадии адгезии тромбоцитов фон Виллебранда фактор (vWF), иммобилизованный на коллагене субэндотелия сосудов с высокой скоростью сдвига, связывает ГП Iba комплекса ГП Ib/IX/V на мембране тромбоцита и запускает внутриклеточную сигнализацию, активацию тромбоцитов, освобождение АДФ и экспонирование интегрина aIIbb3 - рецептора vWF и фибриногена.  

• Коллаген субэндотелия взаимодействует с рецепторами на тромбоцитах - ГП VI и интегрином a2b1, и активирует адгезию и агрегацию клеток.

•  Фибриноген крови, взаимодействуя с интегрином aIIbb3, выполняет функции мостика между активированными тромбоцитами. В стабилизации агрегатов тромбоцитов участвуют адгезивные белки: тромбоспондин и фибронектин, а также P- селектин и CD40 лиганд

• Тромбин активирует тромбоциты, расщепляя рецепторы, активируемые протеазами (РАR, преимущественно РАR-1), сопряженные с G-белками,  и вызывая конформационные изменения, аутоактивацию рецептора и запуск внутриклеточной сигнализации, в том числе активацию фосфоинозитидного пути и образование вторичных посредников (ИФ₃, ДАГ, [Ca+2]i и др).

• Активация фосфолипазы А₂   (ФЛА₂) при повышении концентрации внутриклеточного кальция ([Ca+2]i) ведет к освобождению из мембранных фосфолипидов арахидоновой кислоты и синтезу семейства простагландинов: в тромбоцитах – активатора агрегации тромбоцитов - тромбоксана А₂ (TxА₂ ), а в эндотелии - ингибитора агрегации –простациклина(PGI₂).

•      АДФ взаимодействует со специфическими пуриновыми рецепторами на тромбоцитах и вызывает обратимую (через активацию P2Y₁) и необратимую агрегацию (через P2Y ₁₂) тромбоцитов в зависимости от концентрации АДФ.

• Основные ингибиторы агрегации тромбоцитов – простациклин, оксид азота и АДФ- аза, расщепляющая агонист агрегации – АДФ.

 

       СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

 

VWF- фон Виллебранда фактор

ICAM-1, ICAM-2-  внутриклеточные адгезивные молекулы

VCAM - сосудистых клеток адгезивная молекула;

CD40 - тип I трансмембранных рецепторов

ТФ -Тканевой фактор

PAI-1 - ингибитор активаторов плазминогена

PAF фактор активации тромбоцитов

P -тромбоцитарный селектин

Е - эндотелиальный селектин

PAR- рецептор, активируемый протеиназой

PGI_{2 -} простациклин

NO - оксид азота

AДФ- аденозиндифосфат

ГАГ гликозаминогликаны

гепарансульфат     

APC - активированный протеин С 

EPCR - эндотелиальный рецептор протеина С

TFPI – ингибитор пути тканевого фактора

HS -гепаран сульфат

PS - протеин S

ТМ - тромбомодулин

ГП -гликопротеин

P2Y_1,  P2Y_{12 -}   пуриновые рецепторы АДФ

TP- рецептор тромбоксана

PSGL-1 – лиганд Р- селектина

 ADAMTS-13 – дезинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновым мотивом

 

Глава 1. Структурно-функциональные особенности первичного гемостаза

 

1.1. Гемостаз – физиологическая реакция организма.                  

Гемостаз - физиологический процесс, включает ряд реакций, которые обеспечивают:

• быструю остановку кровотечения при повреждении сосудистой стенки,
• восстановление целостности кровеносных сосудов и
• утилизацию сгустков крови,
• сохранение крови в жидком состоянии в сосудистом русле.

 

Свертывание крови – составная часть гемостаза, служит одной из основных защитных реакций организма при угрозе кровопотери.  

  В реакциях гемостаза участвует три основные системы: 

· сосудистая,

· свертывающая,

·  противосвертывающая система.

 Реактивность сосудистой системы  определяется состоянием клеток и компонентов стенки сосуда. За функции свертывающей системы отвечают клетки крови, прежде всего тромбоциты (кровяные пластинки), и плазменные факторы свертывания. П ротивосвертывающая система объединяет регуляторы свертывания, к важнейшим из которых относят: ингибиторы активных факторов свертывания и их кофакторы; активаторы и ингибиторы фибринолиза (механизма лизиса сгустка фибрина); компоненты антикоагулянтной системы протеина С.

Патология гемостаза проявляется в тромбозах, прижизненном свертывании крови в сосудах, и в геморрагиях, кровоточивости. При ряде патологий, например синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания, наблюдают сочетание обеих видов нарушений гемостаза - микротромбоз и кровоточивость.