Объекты и модели клонального микроразмножения растений

 

Объектом культуры in vitro могут быть различные ткани, взятые из разных частей растения. Наиболее часто выращивают в изолированной культуре ткани стебля, содержащие камбий; паренхиму корнеплодов и клубней, ткани завязи, первичные меристемы корня и стебля. Гораздо реже культивируют ткани лепестков, пыльников, нуцеллуса, пыльцевых трубок. Происхождение экспланта (местоположение вычленяемой части растения, а также характер самих растений - сеянцы, взрослые деревья и т.д.) играет важную роль при микроразмножении. Многочисленными экспериментами установлено, что экспланты растений, находящихся в ювенильном возрасте могут формировать намного больше побегов и лучше укореняться по сравнению с эксплантами взрослых деревьев.

Существует много методов клонального микроразмножения растений. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, привело к созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения. Основные модели клонального микроразмножения растений:

1. Получение каллусной ткани с последующей регенерацией из него растений.

Как правило, в результате деления клеток плодов, эндосперма, меристемы стебля и корня, паренхимы образуется каллусная ткань. В каллусные превращаются не только клетки, подвергнутые раневому воздействию, но и не испытавшие его, такие, как молодые клетки пыльцы или прорастающие пыльцевые трубки. Каллус выполняет функцию защиты и заживления ран, обладает ярко выраженной регенерационной способностью.

Схема культуры ткани (на примере моркови) и процесса органогенеза в недифференцированной ткани и клеточных суспензиях изображена на рисунке 2.

К настоящему времени с помощью этой модели размножают вяз, хризантемы, гвоздику, подсолнечник, сахарная свекла, морковь, землянику и др.

Однако у этой модели есть ряд недостатков:

а) у многих растений (в том числе у бобовых и зерновых) до сих пор трудно добиться контроля за регенерацией растений из каллусной культуры;

б) каллусные культуры многих растений характеризуются генетической нестабильностью, то есть получить потомство, не отличающееся от маточного растения при данной модели размножения трудно.

Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани. Стабильных в генетическом отношении каллусных культур очень мало (например, сельдерей, амариллис, драцены, томаты, спаржа и др.).

2. Индукция образования адвентивных почек непосредственно на экспланте.

Этот метод основан на способности изолированных частей растения восстанавливать недостающие органы при благоприятных условиях питательной среды и, таким образом, регенерировать целые растения.

Образование адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, стебля, семядолей, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удастся получить свободными от инфекции (Шевелуха и др., 1995).

В качестве экспланта берут онтогенетически молодые ткани: зародыши, семядоли, части гипокотилей 20-30-дневных проростков, так как они обладают лучшими морфогенетическими способностями (Родин и др., 1995).

Образование адвентивных почек, как правило, происходит на питательных средах, содержащих стимуляторы роста: цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений.

Таким способом за рубежом размножают южные виды сосен, елей, лиственниц. Из одного зародыша можно получать до 1000 хвойных и до 50 тыс. – 1 млн. лиственных растений в год.

При использовании данной модели возможно размножать луковичные цветочные растения (тюльпаны, лилия, нарциссы, гладиолусы и др.), некоторые виды яблонь и груш, актинидию, малину, землянику, цветную капусту, лук, чеснок, картофель, томаты, и другие.

3. Пролиферация пазушных побегов (активизация развития уже существующих в растении меристем - пазушных и спящих почек стебля).

Этот способ может осуществляться двумя путями:

1) получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на “однопочковые микрочеренки”, которые используются впоследствии. Так можно получить за два месяца один побег, дающий 10 “микрочеренков”. Теоретическая возможность такого способа - от 100 тыс. до 1 млн. побегов в год.

2) формированию побегов с укороченными междоузлиями введением в питательную среду цитокининов, при этом пазушные почки дают начало новым побегам. Теоретически таким способом за один год можно из одного эксплантата получить до 15 млрд. почек или побегов.

Эта модель стала уже промышленным методом при производстве безвирусного посадочного материала некоторых культур. За рубежом таким способом размножают плодовые, тополя, ивы, берёзы, дуб, тую, можжевельник, секвойю. В нашей стране в Уфе размножают гибриды тополей с осиной, в Воронеже – дуб и карельскую березу (Родин и др., 1995)., в Главном Ботаническом саду РАН – формы садовой рябины и др. В сельском хозяйстве этот способ применяют в России в промышленных масштабах при выращивании картофеля и цветочных.

4. Соматический эмбриогенез – формирование неполовым путем зародышеобразных структур, которые напоминают обыкновенные зародыши (Родин и др., 1995).

Исследования показали, что каллусная клетка способна превратиться в клетку, дающую начало зародышу растения. Она подобна оплодотворенной яйцеклетке, или зиготе, хотя никакого оплодотворения не было, так как возникла в результате деления неполовых (соматических) клеток. Это явление называют соматическим эмбриогенезом в культуре ткани.

Это наиболее перспективный способ, так как посадочный материал получается в 2 раза быстрее, а коэффициент размножения на 1-2 порядка выще др. способом микроклонального размножения. Например, в одной колбе за 10-12 дней культивирования можно получить от 5 до 10 тыс. соматических эмбриоидов (на примере моркови) (Родин и др., 1995).

Этот способ в настоящее время используется для осины, дуба, эвкалипта, ели обыкновенной, винограда, злаковых (пшеница, ячмень), редиса, моркови и др. (Шевелуха и др., 1995).

При этом методе можно получать «искусственные семена», т.е. зародыш заключают в специальную оболочку, в состав которой должны входить биологически активные вещества (гормоны, витамины, ферменты и др.). Такие «семена» можно будет высевать, хранить и т.п. Этот метод широко применяется во Франции, США, Японии и др. В нашей стране он пока только на стадии исследования. Получены «искусственные семена» для дуба скального, красного, липы обыкновенной и крупнолистной, ореха грецкого, лиственницы европейской, ели европейской, псевдотсуги тисолистной ели белой (Родин и др., 1995; Калашникова, Родин, 2001). Для сосны этот метод носит поисковый характер. Например, было выделено три вида каллуса: белый клейкий, белый, распадающийся на отдельные кусочки и рыхлый светло-зеленый. Оказалось, что к эмбриогенезу способны лишь каллусы первого типа, т.е. белый клейкий.

 

Контрольные вопросы:

1. Модели клонального микроразмножения растений.

2. Преимущества и недостатки каждой из моделей размножения.

3. Какие виды растений размножают с помощью соматического эмбриогенеза, пролиферации пазушных побегов, индукции образования адвентивных почек, из каллусной ткани?

 

1.3 Факторы, влияющие на процесс микроклонального размножения

На успешное проведение работ по клональному размножению большое значение оказывают следующие факторы:

1. Эксплант

а) Из всех факторов, определяющих успех клонального микроразмножения, наибольшее значение имеет генотип исходного растения. Экспериментально доказано (Шевелуха и др., 1995), что двудольные травянистые растения имеют более выраженную способность к индукции заложения адвентивных почек, росту побегов, укоренению и в конечном итоге получению более высокого коэффициента размножения, чем ткани и органы однодольных травянистых и тем более древесных растений.

Существенно влияет родовые, сортовые и формовые особенности исходного экспланта. Так выделяются формы ели обыкновенной с четко выраженной мутовчатостью и отсутствующей мутовчатостью. Из изолированных зародышей у 1-й группы образовались адвентивные почки у 62 % эксплантов, у 2-й – только 28 %.

б) На процесс возникновения, формирования и развития органов (органогенез) у потомства и его генетическую стабильность значительное влияние оказывает размер экспланта. Чем меньше эксплант, тем меньшей регенерационной способностью он обладает (но в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов). Оптимальная величина экспланта зависит от видовых особенностей растений (для малины – 2 мм, хмеля – 0,1-0,2 мм, лук, чеснок – 0,5-0,8 мм).

в) физиологический возраст экспланта. Лучше регенерируют зрелые зародыши и 20-30-дневные проростки (ювенильный материал) или их части, например, из одного изолированного зародыша лиственной древесной породы можно получить до 100 тыс. растений за год, а из почек взрослого растения – в 100 раз меньше. Зародыши сосны могут образовывать адвентивные почки в 67 % случаев, 20-30-дневные проростки – 48 %, 2-летний материал – 10 %, 5-летний – 2-3 %, 15-летний – 0 %. К тому же на тканях и органах взрослых растений через 2-3 пересадки образуются «отмершие» участки, которые ведут к гибели экспланта (Калашникова, Родин, 2001).

У растения эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых листьев - только побеги, а из средних по возрасту листьев - корни и побеги.

г) время изолирования экспланта (экспланты, изолированные в фазу активного роста, более склонны к укоренению и развитию побегов по сравнению с эксплантатами, изолированными в фазу покоя). Так, для осины процент почек, способных развиваться в побеги, при изолировании их в январе был 21,1-42,2 %, мае – 43,2-85,6 %, октябре – 29,8 –47,6 %.

2. Физические факторы выращивания

а) Температура. Тепловой режим зависит от вида растения и культивируемой ткани. Оптимальная температура по В.С. Шевелуха и др. (1995) для большинства культивируемых тканей – 25-26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29-30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18-20 °С. А.М. Смирнов (приведено по Бутенко, 1975) отмечает, что оптимальная температура для культуры корней у двудольных - 25-27 °С, у однодольных - 20-25 °С, голосеменных - 18-20 °С. По данным Э.И. Быченковой (1977), древесина ветвей хвойных регенерировала при 25 °С, хвоя - при 23-24 °С. Листья (на примере тополя) - при температуре 21-23 °С. Культура зародышей успешна при температуре 25-30 °С.

У некоторых видов растений температура влияет на тип морфогенеза: у фаленопсиса при температуре 28 °С из почек регенерируют вегетативные побеги, а при 20 °С – генеративные.

б) Свет. Е.А. Калашникова и А.Р. Родин (2001) отмечали, что изолированные ткани растений выращивают при той интенсивности освещения, к которой привычно материнское растение.

Однако свет не всегда является необходимым для выращивания культур in vitrо. Например, культуру корней можно выращивать в темноте. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается гетеротрофно, их выращивают в темноте или при рассеянном свете, а для успешного морфогенеза их переносят в помещение с интенсивным освещением (1000-4000 лк.) (Шевелуха и др., 1995). Исключение составляют зеленые каллусные ткани (например, ткань мандрагоры). И.В. Сапраев и др. (1997) при изучении влияния света на рост каллусной ткани василистника малого обнаружили, что каллусная ткань растет лучше при облучении красным или обычным светом. При ультрафиолетовом облучении ткань становится водянистой.

Зеленые ткани растений целесообразно выращивать на свету. На первых этапах клонального размножения оптимальная интенсивность освещения для большинства растений составляет 1000-3000 лк. Продолжительность освещения, в основном, 14-16 часов в сутки. При подготовке растений к переносу в почву интенсивность освещения повышают, как правило, до 10000 лк.

Прямой солнечный свет тормозит рост тканей и вызывает некрозы (Бутенко, 1964).

На интенсивность и характер роста изолированных тканей влияет и спектральный состав света. У берёзы при красном свете укоренение микрочеренков около 100 %, при белом – несколько меньше, при синем – только у половины черенков образуются корни, в темноте – еще меньше. У ткани табака красный свет вызывает образование цветочных почек, фиолетовый и ультрафиолетовый свет – адвентивные почки (в каллусе), а темнота стимулирует образование корней. У подсолнечника более интенсивно стимулирует образование почек белый, красный и голубой свет, чем зелёный.

в) Влажность воздуха. Относительная влажность воздуха в камерах для выращивания культур in vitrо обычно поддерживается на уровне 65-75 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой. При пересадке в почву размноженные в пробирках растения нуждаются в повышенной влажности, что достигается созданием в камерах атмосферы “тумана” (около 80%).

 

3. Стерильность.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является строгое соблюдение стерильности. Богатая питательная среда - прекрасный субстрат для развития в ней микроорганизмов. Поэтому необходимо стерилизовать эксплант, культуральное оборудование и питательную среду.

Инфекция, наблюдаемая в культурах растительных тканей, может быть систематической и случайной. В первом случае необходимо проанализировать все операции подготовки, стерилизации среды, тканей, помещений, чтобы обнаружить ошибку, определяющую эту систематическую инфекцию.

От тщательности подготовки стерильных условий работы и стерильности самого эксплантата, при правильном подборе питательных сред, на 90 % зависит успех эксперимента.

 

4. Питательная среда.

Одним из основных факторов, влияющих на процесс вегетативного размножения in vitro, является правильный подбор питательной среды.

Консистенция питательной среды. Изолированные ткани можно выращивать:

1) на поверхности полутвердой агаровой питательной среды;

Основное преимущество данного способа состоит в том, что ткань, находясь в воздухе, хорошо аэрируется, что очень важно для роста культуры. Также использование твёрдых сред способствует преодолению витрификации (появлению аномальных побегов).

Недостатком этого метода выращивания является то, что ткань хуже снабжается питательными веществами, и плохо удаляются токсические вещества, образующиеся в ходе роста ткани.

2) погруженными в жидкую среду.

 

В.С. Шевелуха и др. (1995) считают, что в жидких питательных средах стимулируется рост ткани, сокращается период выращивания и число пассажей. Однако возрастает вероятность образования аномальных (витрифицированных) побегов и становится проблемой создание хорошей аэрации.

По способу обеспечения аэрации второй метод может быть разделен на 3 группы:

а) выращивание ткани на фильтре, погруженного концами в жидкую питательную среду. Этот способ мало применяется в настоящее время, так как обладает недостатками первого метода;

б) выращивание ткани, погруженной в жидкую питательную среду на качалках и роллерах (рисунок). При этом культуральные сосуды представляют собой запаянные с двух сторон цилиндры с боковым отводом, через который в сосуд вводится ткань. Горловина отвода закрыта ватной пробкой и колпачком из целлофана. При выращивании дисков сосуды поворачиваются, и ткань погружаются в питательную среду, затем, при повороте диска на 180°, остаются в воздухе на стенке сосуда в его верхней части. Недостаток подобных аппаратов в том, что они небольшого объема. Это не позволяет выращивать большие массы тканей и суспензий;

в) Выращивание тканей с продуванием жидкой среды воздухом.

Кислотность среды. Этот фактор определяет для растений доступность питательных веществ. Сильнокислые или, наоборот, щелочные среды лимитируют поступление некоторых элементов (фосфора, железа), делая их плохо растворимыми. Также при большой кислотности эти элементы могут переходить в растворенное состояние и становиться токсичными для эксплантов.

Растительные ткани рекомендуют культивировать на среде с рН, соответствующей кислотности почвы, на которых произрастают эти виды в естественных условиях (для ели – более кислые, для лиственницы – более щелочные и.т.п.). Чаще всего значение данного показателя доводится до 5,6-5,8 (Шевелуха и др., 1995). У ели обыкновенной – оптимальное значение рН равно 5,2-5,6. У сосны – 5,2. При рН = 4,7 у сосны обыкновенной способность зародышей образовывать адвентивные почки понижается в 2,5-3 раза.

Состав питательной среды является одним из основных факторов, влияющих на процесс вегетативного размножения in vitro.

Питательная среда должна включать такой набор веществ и в таких пропорциях, которые обеспечивают деление и рост размножаемой ткани. Любая питательная среда для выращивания культуры изолированной растительной ткани включает в свой состав следующие большие группы веществ: минеральные соли - макро- и микроэлементы, углеродное питание, витамины, аминокислоты, стимуляторы роста (синтетического и натурального происхождения), агар (в случае выращивания тканей на твердой среде), вода (как правило, бидистиллированная).

а) Минеральное питание

- Макроэлементы. Хеллер в 1953 году пришел к выводу, что отсутствие в питательной среде азота, калия, кальция, магния, серы, фосфора приводит к гибели культуры. Наличие натрия и хлора не является обязательным, хотя иногда стимулирует рост тканей.

Потребность ткани в элементах минерального питания зависит от ее физиологических особенностей: для быстрорастущих молодых тканей необходимо присутствие в среде больших доз калия; старые ткани требовательны к присутствию кальция.

- Микроэлементы.Отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % и в последующем приводит к гибели культуры. Внесение в питательную среду раствора микроэлементов особенно важно при культивировании тканей в жидкой среде.

б) Углеродное питание

В качестве источников углеродного питания могут применяться сахара, спирты и органические кислоты. Лучше всего для этих целей использовать сахара. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Например, для ткани моркови лучшим источником углеродного питания является сахароза, затем глюкоза, мальтоза, раффиноза, фруктоза и т.д., то для ткани секвойи лучшей считается фруктоза.

Рост культур обычно прекращается при повышении концентрации сахара до 6-8 % (Бутенко, 1975). Сахарозу чаще всего используют в концентрации 3 %. Но для зародышей ели обыкновенной при такой высокой концентрации сахарозы уже на втором пассаже наблюдается гибель всех эксплантов (в данном случае оптимальная концентрация - 0,5-1 %) (Шевелуха и др., 1995). А для корня сахарной свеклы, который в естественных условиях накапливает много сахара, - 10 % (может расти даже при 20 %) (Холодова и др., 1975). Для кокосовой и финиковой пальм – 14 %, кактуса – 10 %, кукурузы – 8 % (приведено по Холодовой, 1981).

Из спиртов в качестве единственного источника углеродного питания может использоваться только глицерин. Такие спирты, как метанол, этанол, глицерин (в концентрации до 0,5 %) можно добавлять к сахарам. В таком случае они стимулируют рост ткани. Пропанол и бутанол токсичны в любых концентрациях.

Органические кислоты плохо используются тканями.

в) Витамины

Большинство тканей, культивируемых in vitro, способно к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов. Однако, при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Наиболее важную роль в росте культуры тканей играют витамины групп В. Для улучшения роста культур изолированных тканей к среде обычно добавляют смесь из трех витаминов, а именно В1, В6 и никотиновой кислоты, предложенную Уайтом для выращивания корней.

Для тканей древесных растений применяют смесь из 8 витаминов, предложенную Жакио: витамин В1; пантотенат Са; биотин; мезо-инозит; рибофлавин; никотиновая кислота; парааминобензойная кислота; фолиевая кислота.

г) Стимуляторы роста - физиологически активные вещества, стимулирующие процессы роста и развития растений (ауксины, гиббереллины, цитокинины).

Ауксины - вещества, стимулирующие рост стеблей, листьев и корней; гиббереллины - вещества, ускоряющие деление клеток в зоне, непосредственно примыкающий к верхушке стебля, и способствующие его удлинению; цитокинины - вещества, активизирующие деление клеток, участвующие в образовании стеблей и корней, дифференциации новых органов.

Наиболее часто при микроклональном размножении применяют цитокинины (кинетин, БАП и др.), ауксины (ИУК, НУК и др.). Иногда добавляют гибберелловую кислоту, которая стимулирует рост и вытягивание (элонгацию) сформировавшихся почек и способствует получению растений с хорошо развитой надземной частью.

Также в качестве стимуляторов роста широко применяют солодовый, дрожжевой экстракты, томатный, апельсиновый и арбузный соки, эндоспермы из незрелых плодов и семян растений. По мнению Р.Г. Бутенко (1964), наибольшим стимулирующим действием обладают незрелые эндоспермы семян растений. Экстракты из молодых растущих органов и частей растений – стимулируют, а из зрелых семян и органов, находящихся в стадии покоя – угнетают рост тканей.

Без добавления к питательной среде стимулирующих веществ в культуре способны расти только опухолевые ткани и камбиальные ткани некоторых видов (моркови, ивы). Однако нужно помнить, что при высокой гормональной насыщенности среды возможно угнетение роста ткани вплоть до гибели.

Питательную среду готовят в день стерилизации. Берут 0,3-2 %-ный агар на бидистиллированной воде. К раствору агара приливают растворы минеральных солей. Среду стерилизуют паром под давлением 0,75 атм и высокой температурой 115 °С в течение 20-30 минут трехкратно через 20-24 часов. Затем, охладив ее до 50-60 °С, добавляют экстракты и добавки, простерилизованные холодным способом (с использованием бактериальных фильтров). Долго хранить среду нежелательно.

В приложениях А и Б приведены названия и составы питательных сред, используемых для культуры тканей древесных растений (приведено по М.М. Котову и др., 1979).

 

Контрольные вопросы:

1. Что такое эксплант?

2. Как влияют на микроразмножение: генотип исходного растения, размер и возраст экспланта, время изолирования?

3. Физические факторы выращивания.

4. Оптимальные условия культивирования тканей.

5. Стерильность.

6. Виды инфекций.

7. Консистенция питательной среды.

8. Преодоление недостатков жидких и твердых питательных сред

9. Состав питательных сред.

10. Приготовление питательных сред.

11. Кислотность питательных сред.