Сущность культуры изолированных тканей и клеток

 

Каждая отдельная живая клетка несет в себе полную наследственную генетическую информацию о материнском организме. На этой особенности живых клеток основан метод размножения растений в культуре изолированных тканей. Живые клетки самой разной дифференциации (эндосперм семян, элементы цветка, листа, корня и др.) будучи изолированы, способны размножаться, а при подходящих условиях превращаться в клетки, подобные зиготе, и давать начало зародышу, а затем и целому организму.

Особенно важно взаимодействие с соседними клетками той же ткани. При изолировании не отдельной клетки, а ткани или органа большинство генов заблокировано из-за взаимодействия с соседними клетками той же ткани; чаще всего из ткани или органа можно получить большое количество такой же ткани или орган.

Например, от проросшего семени можно отделить кончик корня и поместить его в колбу с питательной средой. Из этого кончика вырастает целый корень, который дает начало боковым корням и через 7-10 дней прекращает рост. Чтобы рост возобновился, от выросшего корня снова отделяют кончик и пересаживают на свежую питательную среду; цикл повторяется. Так можно делать длительный период времени (изолированные корни томатов, полученные Уайтом в 1934 году, до сих пор выращивают и размножают во многих лабораториях мира). В настоящее время ученые научились выращивать из отдельных тканей различные органы.

Если клетку отделить, освободив её от влияния соседних клеток, подобрать правильно питательную среду, то такая клетка ведет себя подобно зародышевой и из нее вырастает целое растение.

В опытах Стьюарта в США и Р.Г. Бутенко в СССР брался маленький кусочек корня моркови и помещался в питательную среду. Ткань моркови начинала быстро расти, и за 20 дней увеличивала свой вес примерно в 80 раз. Клетки этой ткани делились и размножались, но не дифференцировались. Получалось скопление однотипных клеток. Затем брали одну клетку из этого скопления и помещали ее в новую питательную среду, при надлежащем подборе среды из одной клетки удавалось вырастить новое целое растение моркови с корнями, листьями, цветами и семенами (приведено по М.В. Волькенштейну, 1972).

Первые попытки выращивания растений из отдельных тканей предпринимались еще в XIX веке, но неудачно. Лишь в 1932 г. независимо друг от друга француз Р. Готре и американец Ф. Уайт добились хороших результатов.

История развития данного направления науки в нашей стране неоднозначна. Так, в 1917 г. под руководством Н.К. Кольцова был открыт Институт экспериментальной биологии. В 1921 г. В.Н. Сукачев поставил перед лесоводами проблему «преодоление барьера времени», к решению которой приступили сотрудники научно-исследовательских и лесных вузов. В 1933 г. в Ленинграде был организован Институт генетики АН СССР, возглавляемый до 1940 г. Н.И. Вавиловым. Однако основные работы по культивирования тканей и органов растений стали проводиться с 1957 года. В 1965 г. был сформирован научный совет по проблемам селекции и учреждено Всесоюзное общество генетиков и селекционеров.

Этапы развития культуры изолированных тканей и органов растений (приведено по Е.А. Калашниковой и др., 2001):

1.1892-1922 гг. Немецкие ученые Хаберландт, Фехтинг, Рехингер пытались культивировать в растворе сахарозы растительные ткани, но неудачно. Только для стеблей одуванчика и тополя был получен каллус. Хаберландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой растительной клетки. В 1909 г. Уэббер предложил термин «клон» для растений, полученных бесполым путем.

2. 1922-1932 гг. Независимо друг от друга американский ученый Робинс и немецкий исследователь Котте показали возможность культивирования на твердых питательных средах меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Французский ученый Р. Готре сообщил о способности вяза и сосны образовывать каллус in vitro.

3. 1932-1940 гг. французский исследователь Р. Готре и американчкий ученый Ф. Уайт показали возможность длительного культивирования in vitro растительных тканей за счет их пассирования.

4. 1940-1960 гг. Оценено положительное влияние натуральных экстрактов, таких как эндосперм кокосовых орехов, каштана, кукурузы и др. для размножения in vitro. В 40-х гг. выяснилась способность вяза к образованию адвентивных почек. С открытием в 1955 г. Скугом и Миллером цитокининов стало возможным стимулировать деление клеток ткани. В 1957 году впервые были получены целые нормальные растения из клеток каллуса Эрикссоном и Скугом (Картель, 1989). В 1959 г. французский исследователь Жорж Морель с помощью метода культуры изолированных меристем получил первые регенеранты орхидей. Никелл и Тулик разработали метод культивирования отдельной клетки с помощью ткани-няньки, а также клеточных суспензий.

5. 1960-1975 гг. Матес в середине 60-х гг. получил первые растения-регенеранты осины. В 1960 г. английским професором Коккингом разработан метод получения и культивирования протопластов. В 1970 г. Пауэр с учениками осуществил искусственное слияние протопластов. В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений. В институте физиологии растений им. Тимирязева проф. Р.Г. Бутенко было изучено микроразмножение картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, яблони, абрикоса, лимона, тополей, сосны обыкновенной, ели обыкновенной.

6. 1975 г. - по настоящее время. Продолжается быстрое развитие техникиin vitro; разрабатываются методы электрослияния протопластов, клеточной селекции, мутагенеза и др. В сельскохозяйственной академии им. Тимирязева создан банк редких, декоративных, цветочных и исчезающих видов растений. Разработаны технологии размножения 16 сортов бегоний, 10 сортов хризантем, 8 сортов гиацинтов, 12 сортов фиалок, 20 сортов лилий и др. растений. В настоящее время размножены in vitro более 200 видов древесных растений. Благодаря технике in vitro удается клонировать 30-100-летние деревья дуба. Разработана техника микроклонирования плюсовых деревьев ильма, черешни, робинии, секвойи, осины и др. пород. У пихты доказана возможность соматического эмбриогенеза. С помощью техники in vitro предпринимаются попытки включения в геном тополя факторов устойчивости против бактериального рака (Gebhardt, 1995).

При работе с растительными тканями использовались в основном экспланты травянистых растений, так как ткани древесных культур оказались трудным объектом для культивирования. Однако в последнее время возрос интерес к использованию культуры тканей для размножения культурных и дикорастущих деревьев.

Преимущества вегетативного размножения в культуре ткани перед другими видами вегетативного размножения (Катаева, Аветисов, 1981):

1. Коэффициент размножения при использовании данного метода вегетативного размножения намного выше (из одной вершинки яблони за 8 месяцев культивирования можно получить до 60 тыс. побегов);

2. Рост растений в лабораторных условиях можно поддерживать круглый год;

3. Данный метод размножения требует небольших площадей (тысячи растений могут разместиться на лабораторной площади);

4. Этим методом можно размножать растения, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно (пальмы);

5. Одновременно с размножением часто происходит оздоровление растений от вирусов и патогенных микроорганизмов.

6. Обычные методы вегетативного размножения часто малоэффективны, особенно для особей старше 10-15 лет.

В зависимости от типа изолированной ткани и ее свойств возможны два пути получения растений-регенерантов:

1) Образование целых растений из уже существующих растительных структур (развитие почек, образование побегов на культивируемых верхушках стебля и т.д.);

2) Формирование в культуре каллусных тканей из отдельных клеток и развитие их в целые растения (если сегменты корня или стебля поместить на питательную среду в колбу, то они образуют каллусную ткань, которая впоследствии дает начало новым органам.

Весь процесс вегетативного размножения в культуре ткани можно разделить на несколько этапов

1 - Эксплантирование исходной ткани растения. На этой стадии необходимо получить культуру, свободную от инфекции, добиться ее выживания на питательной среде и обеспечить быстрый рост экспланта.

2 - Собственно микроразмножение, то есть образование микропобегов на экспланте.

3 - Укоренение размноженных побегов и содержание их в прохладном помещении. На этом этапе нужно обеспечить развитие нормальной корневой системы, после чего растения хранят при пониженных температурах, что позволяет задерживать рост растений и использовать их длительный период времени. В последнее время предложен метод укоренения растений в условиях гидропоники. Укоренению микропобегов способствует также добавление в питательную среду активированного угля или затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей (Калашникова, Родин, 2001).

4 - Подготовка растений к высадке в почву. На этом этапе проводят закалку растений, повышают их устойчивость к патогенным микроорганизмам и неблагоприятным факторам внешней среды. При этом обычно повышают влажность воздуха до 80 % и увеличивают интенсивность освещения до 10000 лк.

Высадку растений-регенерантов в субстрат лучше проводить весной. Растения с 2-3 листьями и хорошо развитыми корнями вынимают из культуральных сосудов. Корни отмывают от питательной среды и высаживают в предварительно простерилизованный почвенный субстрат. Горшочки с растениями помещают в теплицы. Через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей.

Контрольные вопросы:

1. Способы размножения

2. Преимущества вегетативного размножения

3. Естественные и искусственные методы вегетативного размножения

4. Вегетативное размножение в культуре ткани (in vitro)

5. Преимущества вегетативного размножения in vitro перед другими видами вегетативного размножения

6. Этапы клонирования в культуре ткани