Хранение культуры клеток и тканей растений

а) Пассирование культуры тканей

Образовавшийся на кусочке ткани каллус может быть изолирован и перенесен на питательную среду для самостоятельного роста в пассированной культуре. Каллусные клетки, возникшие из любой исходной ткани, можно выращивать на питательных средах очень долго (в течение десятков лет). Каллусная ткань в культуре в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого или зеленого цвета. Темно-коричневыми каллусные ткани становятся при старении.Пассирование осуществляют для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток (Шевелуха и др., 1995).

Периодические пересадки (пассажи) делают частью образовавшихся клеток через каждые 3-4 недели на свежую питательную среду (хотя наблюдать за ней надо 1 раз в неделю, чтобы не допустить обезвоживания и потемнения ткани) (Урманцева, 1988).

Большинство эксплантов образуют первичный каллус, который можно субкультивировать через 6-8 недель. Частота дальнейших пассажей (переноса части каллуса на свежую питательную среду) определяется скоростью роста ткани, диаметром культурального сосуда и количеством питательной среды.

Причины, по которым необходимо пассирование тканей:

1) Удушение внутренних участков ткани и постепенное удлинение путей доставки питательных веществ ко всем участкам ткани;

2) Истощение среды;

3) Механическое давление стенок культурального сосуда.

При пассировании тканей вначале удаляются отмершие части ткани. Затем, ткани разделяют на кусочки нужного размера и переносят эти кусочки на свежую питательную среду.

Часто ткань гибнет после 3-4 пассажей. Поэтому важно правильно подобрать питательную среду, а при дальнейшем пассировании проверять важность для данной ткани имеющихся в ней витаминов и стимуляторов роста и при необходимости заменять их другими.

Кроме каллусных тканей разного происхождения в пересадочной культуре можно выращивать ткани растительных опухолей. Растительная опухоль - это масса ткани, лишенная определенной строгой организации, в которой клетки интенсивно делятся. Факторами, вызывающими опухолевый рост в различных частях растения, могут быть вирусы, личинки насекомых, грибы, бактерии, химические канцерогенные вещества, излучения. Опухолевая ткань, возникшая на растении, может быть изолирована, освобождена от инфекции с помощью стерилизации или тепловой обработки и перенесена в культуру in vitrо. Первую свободную от инфекции культуру опухолевой ткани получили в 1942 году Уайт и Браун. В отличие от каллусных культур опухолевые ткани не требуют внесения в питательную среду фитогормонов. Их клетки сами синтезируют гормоны, необходимые для размножения и роста. Опухолевые ткани, выращиваемые in vitrо, используют для изучения биохимии и физиологии опухолевой клетки в сравнении с нормальной.

Недостатки пассирования:

а) Ткани, имевшие при начале культивирования нормальный (диплоидный) набор хромосом, за два года выращивания с пересадками 1 раз в месяц превратились на 95 % в клетки высокоплоидные (число хромосомных наборов достигало в них 8 и более).

В клетках ткани, выращиваемой длительное время на искусственной питательной среде, наблюдалась как полиплоидия (увеличение числа хромосом против нормального диплоидного состояния в несколько раз), так и анеуплоидия (уменьшение или увеличение хромосомного набора на несколько хромосом). Реже обнаруживалась гаплоидия (уменьшение числа хромосом против диплоидного вдвое).

б) На поддержание растущих культур приходится тратить много труда и реактивов.

Поэтому давно предпринимались попытки хранить клетки в условиях пониженного обмена веществ, но перспективными оказались лишь криогенные методы. Так как лишь в глубокозамороженном состоянии обмен веществ полностью прекращается, и отсутствуют значительные физико-химические молекулярные изменения во время хранения (Попов, 1981).

б) Криогенное хранение культур клеток растений

Криосохранение - это глубокое замораживание и хранение при температуре ниже -140° С.

Впервые в жидком азоте были заморожены семена еще в 1905 г. (приведено по А.С. Попову, 1981). Изучение морозостойкости растений и их клеток было начато академиком Н.А. Максимовым в 1908-1912 гг. Эти работы продолжил в 60-е годы ХХ века его последователь И.И. Туманов, который, совместно с коллективом авторов, разработал теорию закаливания растений и изучения морозостойкости на клеточном уровне. Эти исследования были продолжены отечественными и зарубежными учеными, замораживающими растения до умеренно низких (-50 °С) температур. Так, культуры льна были восстановлены после замораживания до -50 °С, клетки табака выдерживали только -30 °С, а клетки моркови, явора и батата хорошо перенесли пребывание в жидком азоте (при -196 °С). К 60-м годам ХХ века уже были созданы банки микробов и клеток высших животных и человека, однако, банка клеток растений создано еще не было, т.к. клетки растений труднее поддаются криогенному хранению, чем клетки животных из-за более крупных размеров клеток, обилия в них воды, сильной вакуолизации.

Преимущества криогенного хранения культур клеток растений:

1. Сохранение генофонда редких и исчезающих видов;

2. Предотвращение генетических изменений в клетках при длительном хранении другими способами;

3. Экономичность данного метода.

Для успешного хранения клеток при замораживании необходимо избежать повреждений. Повреждения клеток при замораживании и последующем оттаивании связано с образованием льда внутри клеток (кристаллизацией) и с их обезвоживанием (дегидратацией). Медленное замораживание может полностью исключить образование льда в клетке (кристаллизацию), но при этом происходит значительное обезвоживание и осмотическое сжатие протопласта. Очень быстрое замораживание не сопровождается дегидратацией, но приводит к возникновению кристаллов льда в цитоплазме. Оптимальная скорость замораживания зависит от проницаемости клеток для воды.

Процедура замораживания-хранения-оттаивания состоит из следующих операций:

1. Подготовка культуры: концентрирование клеток перед замораживанием (увеличение плотности культуры) - в этом случае образование льда затрудняется.

а) в среду добавляют сорбит или маннит (2-6 %) от нескольких суток до 2-3 пассажей. Это уменьшает размер клеток и их вакуолей и увеличивает выживание клеток (на примере клеток моркови, перца);

б) используют аминокислоты (в первую очередь пролин), что связывает воду в клетках;

в) искусственное закаливание к холоду - применяют к зимующим растениям умеренного климата (клеточные суспензии и каллусные культуры помещают в условия с t° от 2 до 5°С на 1-6 недель) (Попов, 1988).

2. Добавление криопротектора. На этом этапе необходимо найти нетоксичный, хорошо проникающий криопротектор. В качестве криопротекторов наиболее часто применяют глицерин, пролин, сахарозу, глюкозу, этиленгликоль и др.

3. Программное замораживание. Криоконсервация происходит в приборах, называемых программными замораживателями, где препарат в ампуле помещается в объем, продуваемый струей паров жидкого азота. Количество паров определяется скоростью охлаждения и зависит от температуры нагрева испарителя, помещенного в емкость с жидким азотом (Волосов, 1988).

В большинстве случаев используется двухэтапное замораживание: сначала понижают температуру со скоростью 1 град/мин до - 70-100 °С, а затем сразу опускают в жидкий азот.

4. Хранение в жидком азоте.

5. Оттаивание. Лучшие результаты получены при быстром оттаивании. При этом ампулы прямо из жидкого азота помещают в баню с теплой водой до исчезновения кристаллов льда.

6. Удаление криопротектора происходит обычно на холоде.

7. Определение жизнеспособности клеток.

8. Рекультивирование. На этом этапе часто применяют приемы для увеличения скорости роста клеток, чтобы избежать выведения новых мутантных холодоустойчивых клеток. Возобновление культур требует от 2 до 6 недель (Попов и др., 1991).

К настоящему времени после хранения в жидком азоте возобновлены культуры тополя, гвоздики, риса, сахарного тростника, моркови, кукурузы, томатов, картофеля, морозостойких плодовых деревьев и др.

 

Контрольные вопросы:

1. Методы хранения изолированных тканей.

2. Пассирование.

3. Причины, по которым необходимо пассирование тканей

4. Техника пассирования

5. Недостатки пассирования

6. Криогенное хранение культур клеток и тканей растений

7. Преимущества криосохранения тканей и креток

8. Этапы криогенного хранения.

9. Способы предотвращения повреждений и мутаций тканей при различных способах их хранения.