Рост и культивирование микроорганизмов.

Рост микроорганизмов зависит от наличия в субстрате:

1. Вода. Грибы способны расти на субстрате с содержанием воды 12%, бактирии – 20%.

2. Макроэлементы: углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, кальций, магний, железо.

3. Микроэлементы: марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, бор, кремний, хлор, натрий.

4. Дополнительные вещества, которые называются факторами роста. Это аминокислоты, витамины, дрожжи. Организм, который нуждается в факторах роста, называется ауксотрофным.

5. Углекислый газ. В нем нуждается большинство микроорганизмов, т.к. он не только источник углерода, но и выполняет каталитические функции и синтез различных клеточных компонентов.

Классификация питательных сред.

1. По составу:

· Естественные или натуральные – состоят из продуктов животного и растительного происхождения (животные ткани, соки, молоко и другие);

· Неопределенного состава – имеют сложный не вполне уточненный состав (мясопептонный агар – МПА, мясопептонный бульон – МПА и другие);

· Синтетические – в их состав входят только определенные химически чистые соединения в точно указанных концентрациях.

2. По назначению:

· Элективные (избирательные) или диагностические (распознавательные);

· Дифференциальные (индикаторные).

3. По физиологическому состоянию:

· Жидкие – для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов;

· Плотные – для выделения чистых культур, изучения морфологических признаков;

· Сыпучие.

Условия роста.

Даже при удовлетворении всех потребностей в питательных веществах рост микроорганизмов зависит от определенных условий.

1. рН среды. Оптимум 7. Ацидофильные микроорганизмы – 1-1,5 (грибы, тионовые бактерии). У бактерий нет толерантности к кислотам, как у грибов.

2. Температура. К температуре микроорганизмы относятся по-разному. Мезофилы – t= +20- +37^оС до 45 ^оС. Термофилы – выше 45 ^оС до 90-100 ^оС. Психрофилы и железобактерии – ниже 20 ^оС. Криофильные – от 0 ^оС до -10 ^оС.

3. Осмотическое давление – минеральный состав сред. Микроорганизмы способны расти в средах с содержанием солей от 1% до 10%.

4. Кислород необходим в качестве акцептора электронов, для обеспечения роста у аэробных микроорганизмов. Аэробы и анаэробы бывают облигатные, т.е. строгие, и факультативные – не обязательные, условные.

Физиология роста.

Под ростом понимают увеличение количества живого вещества, сопровождающегося увеличением и делением клеток. У многоклеточных микроорганизмов увеличиваются размеры организма, у одноклеточных - число клеток и масса.

Концентрация клеток – определенное количество клеток в гомогенной (однородной) суспензии (число клеток в 1 мл).

Плотность – отношение массы клеток к объему (мг/дм³).

Константа скорости деления – число клеточных делений за 1 час.

Время генерации – время, за которое число клеток в бактериальной популяции удваивается.

Рост бактерии в статистической культуре. Кривая роста.

При внесении бактерий в питательную среду они растут до тех пор, пока содержание каких-либо необходимых компонентов не достигнет минимума, после этого рост прекращается. Если в среду не добавлять питательные вещества и не удалять метаболиты, то получим статистическую бактериальную культуру, т.е. популяцию в ограниченном жизненном пространстве.

Отложив на оси ординат число клеток в экспоненциально растущей популяции, а на оси абсцисс – время, то получим кривую роста (рис.5), которая описывается экспоненциальным законом.

 

lg N (число клеток)

I II III IV

время t

 

Кривая позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности.

I. Лаг-фаза – начальная фаза роста. Она охватывает промежуток времени между инакуляцией (заражением) и достижением максимальной скорости роста. Продолжительность зависит от возраста инакулянта, пригодности среды, адаптации к новым учловиям.

II. Экспоненциальная фаза (логарифмическая) характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Зависит от вида бактерий.

III. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Переход к этой фазе происходит постепенно. Скорость роста ограничивается не только количеством субстрата, но и большой плотностью бактериальной популяции, низким парциальным давлением, токсичностью продуктов обмена. В стационарной фазе может происходить использование запасных питательных веществ, распад клеточных субъединиц, синтез ферментов.

IV. Фаза отмирания. Отмирание клеток и причины их гибели в нормальных питательных средах изучены недостаточно.

 

 

12. Инженерные основы биотехнологии.

 

Биотехнология – процесс производства, протекающий с использованием живых микроорганизмов. Биотехнология теснейшим образом связана с появлением генной инженерии. Биотехнологические процессы используются в производстве ценных биологически активных веществ (антибиотиков, гармонов и т.д.); для предотвращения загрязнения окружающей среды (биологическая очистка); защиты растений от вредителей и болезней, в производстве белков и аминокислот, лекарственных препаратов (интерферона, инсулина, гормонов роста). Биотехнологическими объектами являются микроорганизмы, клеточные ферменты, антитела.

Цель – применение генной инженерии на практике.

Генная инженерия – отрасль молекулярной биологии, изучающая направленные изменения биологической информации клетки для получения живых существ с запрограммированными фенотипическими признаками.

Фенотипические признаки – совокупность всех свойств и признаков особи на определенной стадии развития, сформировавшиеся в результате взаимодействия генотипа с окружающей средой.

Генотип – совокупность всех генов, присутствующих в данной особи.

Синтез генов – выделение гена из клетки-донора; присоединение гена к ДНК (вектору), способная вести его в клетке гена в геном реципиента.

Геном – совокупность хромосом, содержащие единицы наследственной информации – гены.

Наследственные или целенаправленные изменения в генетическом аппарате называются мутациями.

В биотехнологии используются различные аппараты (биологические реакторы).

1. Идеальный проточный реактор с полным перемешиванием (ПРПП). Предназначены для изучения роста культур клеток, поэтому их часто называют хемостатами. Перемешивание в таких реакторах осуществляется с помощью мешалки. Полное перемешивание обеспечивает однородность состава среды и одинаковую концентрацию кислорода. Такие биореакторы обеспечивают достаточно однородные условия, что необходимо для изучения кинетики соответствующих процессов.

Кинетика изучает механизмы скорости микробиологических процессов, основы управляемого количественного биосинтеза. Математически описывает протекающие биопроцессы во времени.

ПРПП используются для изучения и определения параметров реакторов с неполным перемешиванием.

2. В крупномасштабном производстве необходимыми и целесообразными являются периодические процессы, отличающиеся непостоянным несбалансированным ростом клеток, различными метаболитическими процессами, и их активностью в разные периоды. Для таких процессов используются реакторы периодического действия.

3. Идеальный трубчатый реактор полного вытеснения (ТРПВ). В трубчатом реакторе стационарное состояние сохраняется в элементарном объеме потока, перпендикулярном оси реактора. Система сигрегирована (лат. segregare – отделять, удалять), и каждый элемент системы ведет себя как реактор периодического действия. ТРПВ обеспечивает высокую степень превращения субстрата на выходе из реактора, по сравнению с ПРПП. В тоже время в такой реактор необходимо вносить посевной материал.

4. Реакторы с неподвижным слоем биокатализатора. Работа такого реактора определяется свойствами, применяющихся биокатализаторов. В основном применяются катализаторы на основе иммобилизованных (лат. immobilis – неподвижный) клеток. Иммобилизованные клетки обладают рядом преимуществ: создают возможность для осуществления непрерывного процесса (окисления вещества) без вымывания микроорганизмов и изменения генетической природы; позволяют непрерывно отделять продукты и удалять ингибирующие вещества. Примение иммобилизованных клеток в биореакторах дает возможность расширить временной диапазон, в течение которого клетки проявляют свои каталитические свойства.

5. Биореакторы с псевдоожиженным слоем катализатора. Процессы осуществляются в реакторах колонного типа. Псевдоожиженный слой предполагает наличие трех фаз: газ, жидкость, твердое тело. Поток жидкости в таком реакторе направлен снизу вверх по высокому вертикальному цилиндру. Частицы нерастворимого биокатализатора (скопление микроорганизмов, частицы иммобилизованных клеток, ферментов) суспендируются, увлекаемые восходящим потоком жидкости. Частицы катализатора в верхней расширенной части реактора прекращают подъем и вновь поступают в башню. Такие реакторы используются в непрерывных процессах пивоварения.

6. Реакторы с неподвижным слоем катализатора и со струйным течением жидкости. Область применения таких реакторов – обработка сточных вод с помощью биологических капельных фильтров, производство винного уксуса, в нефтеперерабатывающей промышленности для гидрокрекинга и гидроочистки.