Вопрос№11. Генетические взаимодействие между вирусами (комплементация, рекомбинация). Негенетическое взаимодействие вирусов (интерференция, фенотипическое смешение).

При взаимодействии геномов могут наблюдаться такие формы генетических взаимодействий, как множественная реактивация, рекомбинация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготность. При взаимодействии на уровне продуктов генов могут иметь место негенетические взаимодействия: комплементация, интерференция, фенотипическое смешивание и др.Множественная реактивация. Вирусная инфекция может возникнуть при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденными геномами вследствие того, что функцию поврежденного гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден.Вирионы с поражением разных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате чего репродуцируется исходный неповрежденный вирус. Важное значение имеет расстояние между вирионами с поврежденными геномами внутри клетки. Рекомбинация. Генетической рекомбинацией называют обмен генетическим материалом, происходящий между родительскими вирусами. Возможен обмен полными ге­нами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). Образующийся вирус-рекомбинант обладает свойствами, унаследованными от разных родителей.Обычно рекомбинируемые штаммы обладают характерными признаками, которые обозначаются как маркеры. Пересортировка генов. Вариантом рекомбинации является феномен, получивший название пересортировки генов. Она наблюдается при генетических взаимодействиях между вирусами, имеющими сегментированный геном. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты.Существуют определенные группировки (констелляции или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.Перекрестная реактивация происходит в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном интактен(неповреждённый). При смешанной инфекции двумя такими вирусами воз­можна рекомбинация неповрежденных участков генома инактивированного вируса с геномом интактного вируса, и в результате этого процесса появляются штаммы вируса со свойствами обоих родителей. Гетерозиготность. При совместном культивировании двух штаммов вируса может происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или, по крайней мере, один полный геном и часть второго генома.

Негенетические взаимодействия

Комплементация. стимулирует репродукцию обоих партнеров или одного из них, но не изменяет генотипы вирусов. Вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными. Комплементация может быть односторонней и дву­сторонней. Двусторонняя комплементация заключается в репродукции обоих партнеров. При односто­ронней комплементации один из партнеров обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Интерференция вирусов — взаимодействие вирусов, при котором один вирус (или его компоненты) подавляет репродукцию другого вируса и течение вызываемого им инфекционного процесса.Фенотипическое смешивание. При совместном культивировании двух вирусов может наблюдаться феномен фенотипического смешивания, когда геном одного вируса бывает заключен в капсид, состоящий частично или полностью из белков другого вируса.Фенотипическое смешивание наблюдается при смешанной инфекции многими вирусами, причем эти вирусы могут быть как близкими друг другу (например, вирусы гриппа А и В или разные серологические подтипы вируса гриппа А), так и весьма далекими (онковирусы и рабдовирусы).

 

Вопрос№12. Структура геномов вирусов. Типы ДНК и РНК геномов. Просто организованные вирусы представляют собой нуклеопротеиды или нуклеокапсиды и состоят из нуклеи­новой кислоты (РНК или ДНК) и нескольких кодируе­мых ею белков, формирующих вирусную оболочку вокруг нуклеиновой кислоты — капсид.Сложно организованные вирусы содержат дополнитель­ные оболочки, белковые или липопротеидные, и имеют более сложный химический состав. Помимо нуклеиновой кислоты и белков, они содержат липиды в наружных обо­лочках и углеводы в составе белков' наружных оболочек (гликопротеидов). Обычно липиды и углеводы имеют кле­точное происхождение. В составе некоторых вирусов об­наруживаются также клеточные нуклеиновые кислоты и белки. Клетки всех живых организмов содержат два вида нуклеиновой кисло­ты — ДНК и РНК. ДНК представляет собой двунитчатую молекулу, а РНК — однонитчатую. В отличие от клеток вирусы содержат лишь один вид нуклеиновой кислоты — либо РНК, либо ДНК. И та, и другая может быть храни­телем наследственной информации, выполняя таким образом функции генома.Вирусные нуклеиновые кислоты характеризуются поразительным разнообразием форм. Вирусный геном может быть представлен как однонитчатыми, так и двунитчатыми молекулами РНК и ДНК. ДНК может быть как линейной, так и кольцевой молекулой, РНК — как непрерывной, так и фрагментированной и кольцевой молекулой. Вирусные ДНК Молекулярная масса вирусных ДНК варьирует в широких пределах от 1* 10⁶ до 250* 10⁶. Самые большие вирусные геномы содержат несколько сотен генов, а самые маленькие содержат информацию, достаточную для синтеза лишь нескольких белков.В геномах, представленных двунитчатыми ДНК, информация обычно закодирована на обеих нитях ДНК. Это свидетельствует о максимальной экономии генетического материала у вирусов, что является неотъемлемым свойством их как генетических паразитов. Хотя в основном структура ДНК уникальна, т. е. большинство нуклеотидных последовательностей встречаются лишь по одному разу, однако на концах молекул имеются повторы, когда в концевом фрагменте линейной ДНК повторяется ее начальный участок. Повторы могут быть прямыми и инвертированными.Способность к приобретению кольцевой формы, которая потенциально заложена в концевых прямых и, инвертированных повторах, имеет большое значение для вирусов. Кольцевая форма обеспечивает устойчивость ДНК к экзонуклеазам. Стадия образования кольцевой формы обязательна для процесса интеграции ДНК с клеточным геномом. Наконец, кольцевые формы представляют собой удобный и эффективный способ регуляции транскрипции и репликации ДНК.В составе вирионов, содержащих однонитчатую ДНК, обычно содержатся молекулы ДНК одной полярности. Исключение составляют аденоассоциированные вирусы, вирионы которых содержат ДНК либо одной полярности (условно называемой «плюс»), либо ДНК с противополож­ным знаком (условно — «минус»). Поэтому тотальный препарат вируса состоит из двух типов частиц, содер­жащих по одной молекуле «плюс»- или «минус»-ДНК.Вирусные РНК Из нескольких сотен известных в настоящее время вирусов человека и животных РНК-геном содержит около 80% вирусов. Способность РНК хранить наследственную информацию является уникальной особенностью вируса.У просто организованных и некоторых сложно организованных вирусов вирусная РНК в отсутствие белка может вызвать инфекционный процесс.Однонитчатые РНК. Молекулы однонитчатых вирусных РНК существуют в форме одиночной полинуклеотидной цепи со спирализованными ДНК-подобными участками. При этом некомплементарные нуклеотиды, разделяющие комплементарные участки, могут выводиться из состава спирализованных участков в форме различных «петель» и «выступов». Вирусы, содержащие однонитчатые РНК, делятся на две группы. У вирусов первой группы вирусный геном обладает функциями информационной РНК, т. е. может непосредственно переносить закодированную в нем информацию на рибосомы.Вторая группа РНК-содержащих вирусов содержит ге­ном в виде однонитчатой РНК, которая сама не обладает функциями иРНК. В этом случае функцию иРНК выпол­няет РНК, комплементарная геному. Синтез этой РНК (транскрипция) осуществляется в зараженной клетке на матрице геномной РНК с помощью вирусспецифического фермента — транскриптазы.

Вопрос№13. Вирусы с непрерывным и сегментированным геномами. Кодирующая способность вирусного генома. Весьма интересным фактом стало обнаружение вирусов с так называемыми сегментированными геномами. Так, например анализ генома реовирусов (это вирусы человека, приматов, птиц, которые вызывают респираторные и желудочно-кишечные инфекции). В вирусных частицах реовирусов было обнаружено 10 различных молекул двунитевой РНК. Это не были случайно возникшие фрагменты какой-то большой молекулы РНК являющейся геномной молекулой данного вируса. Ибо они были не комплементарны, что говорило о том, что это необходимые компоненты его генетического материала, от которого зависит успех при заражении его вирионами чувствительной клетки. Суммарный вес всех 10 сегментов соответствовал величинам, полученным при определении веса нуклеинового компонента обычными методами. Иными словами геном этих вирусов, конкретно этого вируса, представлен 10 сегментами и эти все сегменты необходимы, для того чтобы вирус заразил клетку и мог в ней репродуцироваться. К числу таких вирусов относится бактериофаг f6, который содержит двунитевую РНК, вирусы животных, содержащих однонитевые РНК, например ареновирусы (вирусы грызунов, вызывающие лихорадочные заболевания-хориоменингиты у чувствительных животных). Некоторые вирусы растений тоже обладают сегментированными геномами. Существуют некоторые различия между вирусами животных, которые имеют сегментированный геном, и вирусами растений тоже с сегментированными геномами. У вирусов животных эти сегменты находятся всегда в одном вирионе, и естественно заражение чувствительных клеток довольно легко осуществляется, если такая частица попадает внутрь клетки. В частности вирус гриппа имеет 6-8 сегментов. Эти сегменты являются молекулами однонитевой РНК, негативными молекулами. Что касается вирусов растений, то тут картина иная. Сегменты РНК-геномов таких вирусов содержатся в разных вирусных частицах. Каждый сегмент в своей вирионной частице. Так, например вирус мозаики костера имеет 4 сегмента РНК - это его полный геном. Но эти сегменты находятся в 3 частицах, причем в одной 2 сегмента. В каждой частице содержится по крупному сегменту и в одной из этих трех содержится четвертый малый сегмент. Причем последовательность нуклеотидов в малом сегменте идентична части последовательности крупного сегмента, вместе с которым он присутствует в вирусной частице. Какова биологическая значимость такого явления толком никто не знает. Но для того чтобы заразить клетки костера данным вирусом требуется, чтобы в клетку попали все 3 вирусные частицы. Только тогда будет осуществляться инфекция. Весьма необычный тип сегментированного генома обнаружен у одного из вирусов растений, вызывающего мозаику люцерны. Этот вирус состоит из 3 вирионов, которые содержат разные молекулы РНК, 4 сегмента и одинаковый капсидный белок. Эти сегменты распределены в 3 вирионах. Причем в одном содержаться 2 сегмента. Малый сегмент детерминирует белок капсида, а 3 крупных сегмента обеспечивают всю генетическую информацию данного вируса. Чтобы развилась мозаичная болезнь люцерны, все 3 вириона должны попасть в одну клетку. Это видимо отображает не особую инфекциозность данного вируса, чтобы в одну клетку попадало сразу 3 вириона.

 

 

 

Вопрос№14. Основные гипотезы происхождения вирусов и факты их подтверждающие. Возможные пути эволюции вирусов.(смотри А.И.Зинченко-стр.17-18) В поисках ответа на вопрос о происхождении вирусов вы­двинуты три гипотезы. Согласно одной из них вирусы могли явиться первичными формами жизни, возникшими в результате химических реакций с использованием энергии ультрафиолето­вых лучей или электроразрядов и давшими начало клеточной организации жизни. С этой прогрессивной гипотезой увязыва­ются две регрессивные. По мнению А. Львова, вирусы, которые индуцировали образование клеток в ходе регрессирующей био­химической эволюции, при каком-то акте мутации могли отще­питься от них, возвратив свою первоначальную независимость и способность к репродукции при наличии ферментов-катализаторов. Вторая регрессивная теория предполагает, что вирусы произошли от свободноживущих микробов, нуждавших­ся в факторах роста и ставших вследствие этого внутриклеточ­ными паразитами, а затем поэтапно утратившими энергообмен­ные системы. Против регрессивной гипотезы происхождения вирусов из паразитарных клеток говорят многие веские аргу­менты, прежде всего их неклеточная организация, способ раз­множения, отсутствие в клетках структур, подобных вирусным капсидам и промежуточных форм превращения клеток-паразитов в вирусы. Наибольшее число сторонников имеет ги­потеза, согласно которой вирусы произошли от содержащих нуклеиновые кислоты структур и органелл клеток, ставших ав­тономными самопроизводящимися элементами. Так, ее привер­женцы полагают, что источником ДНК-вирусов могли явиться гены митохондрий и хлоропластов, а РНК-вирусов - рибосомы или же иРНК клеток и ДНК-содержащих вирусов. При этом не затрагиваются источники получения генного материала одноцепочечных ДНК-вирусов и двухцепочечных РНК-вирусов, а так­же механизм репликации вирионной РНК, которых не имеет ни одна клетка.

Таким образом, вопрос о происхождении вирусов остается дискуссионным и лишь только то, что произошли они от разных предков и, согласно самому факту существования ДНК- и РНК-вирусов, эволюционируют двумя путями, ни у кого не вызывает сомнения.

В заключение отметим, что продолжающиеся дискуссии во­круг альтернативных представлений о природе и происхожде­нии вирусов, внесшие много важного в их познание, ничего об­щего не имеют с бесплодной философской полемикой между материалистами и идеалистами относительно происхождения жизни на Земле или борьбой мнений некоторых вирусологов и микробиологов в отношении того, считать вирусологию само­стоятельной академической дисциплиной или же частью микро­биологии.

 

Вопрос№15. Особенности строения вирусов бактерий и функции отдельных структур. Систематика вирусов бактерий. В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклео-капсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. Бактериофаги устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Большинство из них без вреда переносит высокие температуры (50-70 °С), действие дезинфектаитов (за исключением кислот и формалина), прямой солнечный свет и УФ-облучение в низких дозах. Бактериофаги проявляют иммуногенные свойства, вызывая синтез специфических AT. Типы бактериофагов :В зависимости от взаимодействия капсида с НК частицы вирусов могут быть подразделены на несколько типов симметрии: 1). Кубический тип симметрии. Кубические капсиды представляют собой косайдеры обладающий примерно 20-ю треугольными поверхностями и 12 вершинами. Они формируют напоминающую сферическое образование структуру, но на самом деле это многогранник. В ряде случаев к вершинам таких косаэдрических многогранников прикрепляются особые липопротеиновые образования именуемые шипами. Роль этих шипов предположительно сводится к взаимодействию вирионов или вирусных частиц с соответствующими участками чувствительных к ним клеток хозяев. 2). Спиральный тип симметрии. Спиральные капсиды устроены несколько проще.Т.е.капсомеры составляющие капсид покрывают спиральную НК и формируют тоже достаточно стабильную белковую оболочку этих вирусов. И при использовании высокоразрешающих электронных микроскопов и соответствующих методов приготовления препарата можно видеть спирализованные структуры на вирусах.3 ). Смешанный или сложный тип симметрии. Как правило, такой тип симметрии выявляется главным образом среди бактериальных вирусов. И классическими примерами служат те фаги, кишечной палочки или умеренные фаги. Это сложные образования, имеющие головку с внутренним нуклеиновым содержимым, различного рода придатки, хвостовой отросток, разной степени сложности устройства. И каждый компонент таких частиц наделён определённой фунцкией, реализующейся в процессе взаимодействия вируса с клеткой. Иными словами сложный тип симметрии представляет собой сочетание кубической симметрии, головка – это многогранник косайдер и палочковидные образования – это хвостовые отростки. Хотя среди вирусов бактерий существуют тоже довольно просто организованные вирионы которые являются примитивными нуклеокапсидами, сферической или кубической формы. Наиболее сложно устроенными являются вирусы бактерий, по сравнению с вирусами растений и вирусами животных. И в качестве демонстрации различных морфологических форм вирионов могут быть представлены схемы предложенные: Анной Сергеевной Тихоменко. Группы:• К типу I бактериофагов относят ДНК-содержащие нитевидные фаги, лизирующие бактерии, содержащие F-плазмиды.• Фаги типа II представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174(или более) — однонитевой ДНК. Относительно этих фагов полагают, что белки определённых вершин могут выполнять функцию адсорбционного рецептора. НЕ все вершины могут выполнять эту функцию.• Бактериофаги типа III имеют короткий хвост (например, Т-фаги 3 и 7). имеющие аналог отростка, который служит для прикрепления фаговых частиц к клетке, другие фаги содержат очень короткий отросток с базальной пластинкой и в ряде случаев с короткими нитями.• К типу IV относят фаги с несокращаюшимся хвостом и двухнитевой ДНК (например, Т-фаги 1 и 5 и λ) длинные несократимые отростки.• Фаги типа V имеют ДНК-геном, сокращающийся чехол хвоста, который заканчивается базальной пластиной (например, Т-фаги 2 или (лекция 2 ил 4-5) ил 5 по Бредли «То же самое, только наоборот».Т-чётные фаги являются наиболее сложно организованными вирусами. Головка представляет собой белковую структуру. К головке фага присоединяется хвостовой отросток, довольно сложно организованная белковая структура, состоящая из коннектора, соединяющего головку с хвостовым отростком, воротничка, бакенбардов внутреннего полого ригидного стержня. Полость сообщается с внутренней полостью головки, наружного белкового сократимого чехла, базальной многогранной пластинки с шипами, к которым присоединяются усики – ворсинки и хвостовые нити. Белковая оболочка служит для содержания ДНК и защиты ДНК от внешних воздействий. Дистальная часть хвостового отростка обеспечивает адсорбцию – прикрепление фага к бактериальной клетке чувствительной к фагу. Хвостовые нити являются первыми приспособлениями которые взаимодействуют с поверхностью бактериальной клетки. Фаги адсорбируются на специальных адсорбционных рецепторах клетки и для каждого фага существуют особые рецепторы и чувствительность бактерий к какому-то конкретному бактериофагу определяется наличием соответствующих рецепторов. Белковый капсид без НК называется безнуклеиновый фантом (тень фага). Фактически весь белок фага за небольшим исключением остаётся за пределами бактериальной клетки.

 

Вопрос№16. Наиболее значительные достижения вирусологии и перспективы ее развития. Значение вирусологии в жизни человека. К началу XXI века описано более 6 тыс. вирусов. Для многих вирусов изучены их структура, биология, химический состав и механизмы репликации. в 2003 году был открыт самый большой из известных вирусов – мимивирус.Открытие большого числа вирусов потребовало создания их коллекций, и музеев. Наиболее крупные среди них - в России (государственная коллекция вирусов в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского в Москве), США (Вашингтон), Чехии (Прага), Японии (Токио), Великобритании (Лондон), Швейцарии (Лозанна) и ФРГ (Брауншвейг). В рамках общей, то есть молекулярной вирусологии продолжается изучение фундаментальных основ взаимод. вирусов и клеток. Достижения молекулярной биологии, вирусологии, генетики, биохимии и биоинформатики показали, что знач. вирусов не огранич.только тем, что они вызывают инфек-е забол-я.Было показано, что особенности репликации некот.вирусов приводят к захвату вир.клеточных генов и переносу их в геном другой клетки – горизонтальному переносу генетической информации, что может иметь последствия, как в эволюционном плане, так и в плане злокачественного перерождения клеток.При секвенировании генома человека и др.млекопитающих было выявлено большое число повторяющихся нуклеотидных последоват., представл.собой дефект.вир.Вирусологи осуществляют диагностику вирус.инфекций чел.и жив., изучают их рас-е, разраб-т методы профилактики и лечения. Крупнейшим достижением явилось создание вакцин против полиомиелита, оспы, бешенства, гепатита В, кори, жёлтой лихорадки, энцефалитов, гриппа, паротита, краснухи. Создана вакцина против вируса папилломы, с которым связано развитие одного из видов рака. Благодаря вакцинации полностью ликвидирована натуральная оспа. Осущ. международные программы полной ликвидации полиомиелита и кори. Разрабат.методы профилактики и леч.гепатитов и иммунодефицита (СПИД) чел. Накапл.данные о ве-х с антивирусной актив. На их основе создан ряд лекарственных препаратов для лечения СПИДа, вирусных гепатитов, гриппа, забол., вызванных вирусом герпеса.Изучение вирусов раст. и особенностей их распространения по раст-ю привело к созданию нового направления в с/ х – получению безвирусного посадочного материала. Меристемные технологии, позв-е вырастить раст, своб-е от вир., в настоящее время применяются для картофеля, ряда плодовых и цветочных культур. Исключ. значение на данном этапе им.знания, накопленные о структуре вирусов и их геномов для разв.генной инженерии. Ярким примером этого явл-я исп-е бактериофага лямбда для получения библиотек клонированных последовательностей. Кроме того, на основе геномов разных вирусов создано и продолжает создаваться большое количество генно-инженерных векторов для доставки чужеродной генетической информации в клетки. Эти векторы используются для научных исслед-й, для накопления чужеродных белков, особенно в бак.и раст., и для генной терапии. В генной инженерии применяются некоторые вирусные ферменты, которые теперь производятся на коммерческой основе.Малые размеры и способность к образованию регулярных структур открыли перспективу использования вирусов в нанотехнологии для получения новых бионеорганических материалов: нанотрубок, нанопроводников, наноэлектродов, наноконтейнеров, для инкапсидации неорганических соединений, магнитных наночастиц и неорганических нанокристаллов строго контролируемых размеров. Новые материалы могут быть созданы при взаимодействии регулярно организованных белковых вирусных структур с металлосодержащими неорганическими соединениями. «Сферические» вирусы могут служить наноконтейнерами для хранения и доставки в клетки лекарственных препаратов и терапевтических генов. Поверхностно модифицированные инфекционные вирионы и вирусные субструктуры могут быть использованы в качестве наноинструментов (например, в целях биокатализа или получения безопасных вакцин). последовательности – ретротранспозоны (эндогенные ретровирусы), которые могут содержать регуляторные последовательности, влияющие на экспрессию соседних генов. Их обнаружение и изучение привело к активному обсуждению и исследованию роли вирусов в эволюции всех организмов, в частности в эволюции человека.Открытие вирусов-сателлитов, сателлитных РНК и вироидов расширило понимание явления молекулярного паразитизма, изначально описанного для вирусов, и заставило предположить, что оно играло существенную роль в эволюции макромолекул.Новым направлением вирусологии - экология вирусов. Обнаружение вирусов в природе, их идентификация и оценка их количества представляют собой очень сложную задачу. В настоящее время выработаны некоторые методические приемы, позволяющие оценить количество некоторых групп вирусов, в частности бактериофагов, в природных образцах и проследить их судьбу. Получены предварительные данные, свидетельствующие о том, что вирусы оказывают существенное влияние на многочисленные биогеохимические процессы и эффективно регулируют численность и видовое разнообразие бактерий и фитопланктона.Вирусология превратилась в обширную область знаний, важную для биологии, медицины и сельского хозяйства. Вирусологи осуществляют диагностику вирусных инфекций человека и животных, изучают их распространение, разрабатывают методы профилактики и лечения. Крупнейшим достижением -создание вакцин против полиомиелита, оспы, бешенства, гепатита В, кори, жёлтой лихорадки, энцефалитов, гриппа, паротита, краснухи. Создана вакцина против вируса папилломы, с которым связано развитие одного из видов рака. Благодаря вакцинации полностью ликвидирована натуральная оспа. Осуществляются международные программы полной ликвидации полиомиелита и кори. Разрабатываются методы профилактики и лечения гепатитов и иммунодефицита (СПИД) человека. Накапливаются данные о веществах с антивирусной активностью. На их основе создан ряд лекарственных препаратов для лечения СПИДа, вирусных гепатитов, гриппа, заболеваний, вызванных вирусом герпеса.Изучение вирусов растений и особенностей их распространения по растению привело к созданию нового направления в сельском хозяйстве – получению безвирусного посадочного материала. Меристемные технологии, позволяющие вырастить растения, свободные от вирусов, в настоящее время применяются для картофеля, ряда плодовых и цветочных культур.Исключительное значение на данном этапе имеют знания, накопленные о структуре вирусов и их геномов для развития генной инженерии. Ярким примером этого является использование бактериофага лямбда для получения библиотек клонированных последовательностей. Кроме того, на основе геномов разных вирусов создано и продолжает создаваться большое количество генно-инженерных векторов для доставки чужеродной генетической информации в клетки. Эти векторы используются для научных исследований, для накопления чужеродных белков, особенно в бактериях и растениях, и для генной терапии. В генной инженерии применяются некоторые вирусные ферменты, которые теперь производятся на коммерческой основе.Малые размеры и способность к образованию регулярных структур открыли перспективу использования вирусов в нанотехнологии для получения новых бионеорганических материалов: Новые материалы могут быть созданы при взаимодействии регулярно организованных белковых вирусных структур с металлосодержащими неорганическими соединениями. «Сферические» вирусы могут служить наноконтейнерами для хранения и доставки в клетки лекарственных препаратов и терапевтических генов. Поверхностно модифицированные инфекционные вирионы и вирусные субструктуры могут быть использованы в качестве наноинструментов (например, в целях биокатализа или получения безопасных вакцин).

 

 

Вопрос№17. Титр бактериофага, методы его определения. Медоды выявление вирусов животных и растений. Титр бактериофага - это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бактериофага наиболее широко в работе с бактериофагами применяется метод агаровых слоев, предложенный А. Грациа в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получае­мых результатов и с успехом используется также для выделения бактериофагов.Сущность метода состоит в том, что суспензию бактериофага смешивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее подготовленного 1,5%-го питательного агара в чашке Петри. В качестве верхнего слоя чаще всего применяют 0,7%-й питательный агар. При инкубации в течение 6-18 ч бактерии размножаются внутри верхнего «мягкого» слоя агара в виде множества колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5%-го питательного агара, который применяется в качестве подложки. Низкая концентрация агара в верхнем слое создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц и инфицированию ими бактериальных клеток. Инфицированные бактерии подвергаются лизису, в результате чего появляется потомство фага, которое вновь заражает нахо­дящиеся в непосредственной близости с ними бактерии. Образование негативной колонии для фагов Т-группы вызвано только одной частицей бактериофага, и, следовательно, число негативных колоний служит количественным показателем содержания бляшкообразующих единиц в исследуемом образце.Культура чувствительных к фагу бактерий используется в логарифмической фазе роста в минимальном количестве, обеспечивающем получение сплошного газона бактерий. Соотношение числа фаговых частиц и бактериальных клеток (множественность инфекции) для каждой системы «фаг - бактерия» подбирается экспериментально с таким расчетом, чтобы на одной чашке образовывалось 50-100 негативных колоний.Для титрования бактериофага может быть использован также однослойный метод, состоящий в том, что на поверхность чашки с питательным агаром вносят суспензии бактерий и бактериофага, после чего смесь распределяют стеклянным шпателем. - не нашел широкого применения.Техника титрования и культивирования бактериофагов. Для определения титра бактериофага последовательно разводят исходную фаговую суспензию в буферном растворе либо в бульоне (шаг разведения 10^-1). Для каждого разведения используют отдельную пипетку, а смесь интенсивно перемешивают. Из каждого разведения суспензии делают «высев» фага на газон чувствительных бактерий Е. coli В. Для этого 1 мл разведенного фага вносят в пробирку с 3 мл расплавленного и охлажденного до 48-50°С «мягкого агара», после чего в каждую пробирку добавляют 0,1 мл культуры чувствительного микроорганизма (Е. coli В), находящегося в логарифмической фазе роста. Содержимое перемешивают, вращая пробирку между ладонями и избегая образования пузырей. Затем быстро выливают на поверхность агаризованной (1,5%-й) питательной среды в чашке Петри и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку. При титровании методом агаровых слоев следует засевать параллельно не менее двух чашек одного и того же разведения фага. После застывания верхнего слоя чашки переворачивают крышками вниз и помещают в термостат с температурой 37°С, оптимальной для развития чувствительных бактерий. Учет результатов производят через 18-20 ч инкубирования.Количество негативных колоний подсчитывают аналогично подсчету колоний бактерий, а титр фага определяют по формуле:

где N - количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материала; n -среднее количество негативных колоний на чашку; D - номер разведения; V — объем высеваемой пробы, мл.