Вопрос№2 Лизогенизация бактерий фазмидами

Вопрос№38. Распространение вирусов в организме хозяина и тропизм к определенным тканям.

Лимфатическая система. Лимфатические сосуды являются одним из основных путей, по которым вирус распространяется от места первоначальной локализации (кожа, слизистая оболочка дыхательных путей и пищеварительный аппарат). Примером распространения вирусов по лимфатической системе является поражение лимфатических узлов после подкожной противооспенной вакцинации, при кори и краснухе, инфицирование миндалин и аденоидной ткани при аденовирусной инфекции. Инфицированные лимфатические узлы могут быть вторичным очагом инфекции.

Кровеносная система. Гематогенный путь является основным путем распространения вируса в организме, и вирусемия является обычным симптомом при большинстве вирусных инфекций. В кровь вирусы могут поступать из лимфатической системы, переноситься с помощью лейкоцитов, проникать в кровеносные капилляры из первично инфицированных тканей. Вирусемия поддерживается путем постоянного поступления вирусов в кровь или же при нарушении механизмов элиминации вирусов из крови. Длительность нахождения вируса в токе крови может определяться размером вирусной частицы: более крупные вирусные частицы быстрее устраняются из тока крови, чем мелкие, поэтому вирусемия обычно имеет место при энтеровирусных инфекциях. Некоторые вирусы (например, вирусы оспы) обладают способностью репродуцироваться в клетках сосудистого эндотелия, откуда непосредственно попадают в кровь; многие вирусы фагоцитируются макрофагами, которые разносят их по организму и защищают от иммунных факторов. Доставка вируса макрофагами в лимфоузлы может лишь благоприятствовать инфекции, если вирус размножается в клетках лимфоцитов, поступая оттуда в кровь. Помимо макрофагов, Вирус может связываться с другими клетками крови. Так, вирусы гриппа и парагриппозные вирусы адсорбируются на эритроцитах, вирусы кори, паротита, герпеса, полиомиелита, клещевого энцефалита и др. адсорбируются на лейкоцитах, а некоторые вирусы способны репродуцироваться в лейкоцитах.

Нервные стволы. Нейрогенный путь распространения вирусов вдоль периферических нервов присущ вирусам бешенства, простого герпеса, полиомиелита. Вирус бешенства распространяется от входных ворот инфекции — места укуса — по нервам центростремительно к ЦНС, а оттуда — в слюнные железы, из которых вирус выделяется в слюну. Распространение вирусов герпеса в орга­низме при опоясывающем герпесе происходит не только гематогенным, но и нейрогенным путем, при этом вирус может персистировать в дорсальных ганглиях и при определенных условиях может активироваться и распространяться по чувствительному нерву в обратном направлении. Рецепторы для вирусов герпеса обнаружены в синапсах нервных клеток. Вирус может распространяться по аксонам центробежно и центростремительно со скоростью 200—400 мм в сутки.

Скорость распространения вирусов в организме и достижения чувствительных тканей определяет длительность инкубационного периода. Короткий инкубационный период имеют очаговые инфекции (грипп и другие респираторные инфекции, вирусные гастроэнтериты и др.), длительный — инфекции, возбудители которых попадают в чувствительные ткани после генерализации процесса (вирусные гепатиты).

 

Крупным достижением в разработке противовирусных средств оказались ЛС — аналоги нуклеотидов (аномальные нуклеотиды). Эти ЛС действуют как антиметаболиты, что обусловлено их структурным сходством с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Основные механизмы антивирусного действия препаратов связаны с подавлением активности вирусных полимераз.

Аналогию с нуклеотидами ЛС приобретают в результате их фосфорилирования клеточными и некоторыми вирусными киназами. В форме нуклеотидных аналогов препараты ингибируют вирусные ДНК-полимеразы и/или выступают субстратами для вирусных ферментов; в результате ЛС встраиваются в вирусные нуклеиновые кислоты, образуя дефектные поли нуклеотиды или обрывая их дальнейший рост. Селективный эффект ЛС обеспечивает больший их аффинитет к вирусным полимеразам по сравнению с природными нуклеотидами. Кроме того, вирусные ферменты более лабильны к их действию по сравнению с полимеразами клеток млекопитающих.

Ингибиторы обратной транскриптазы избирательно взаимодействуют с ферментом ретровирусов, включая ВИЧ.

Зидовудин (азидотимидин)

• Зидовудин обладает большим аффинитетом к обратной транскриптазе по сравнению с природными субстратами, тем самым блокируется взаимодействие фермента с последними.

• Встраивание аналога в нуклеотидную цепь вместо тимидина блокирует её дальнейшую сборку, так как азидотимидин не содержит 3'-ОН-группу, необходимую для образования 5'-3'-диэфир-ных связей в составе нуклеиновой кислоты. Ламивудин, ставудин, залцитабин (применяется при развитии резистентности к азидотимидину), диданозин (проявляет меньшую токсичность) имеют аналогичный зидовудину механизм антивирусного эффекта. Невирапин — ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы. Препарат связывает гидрофобные фрагменты молекулы фермента (к чему не способны прочие ингибиторы). Штаммы ВИЧ, устойчивые к нуклеозидным ингибиторам, не обладают перекрёстной резистентностью к этому препарату.

Ингибиторы ДНК-полимераз ДНК-содержащих вирусов представлены препаратами, фосфорилируемыми как клеточными киназами, так и вирусными тимидинкиназами. Видарабин — аналог пурина с четвертичной структурой, аналогичной дезоксиаденозину. Антивирусный эффект этого ЛС связан с подавлением ДНК-полимеразы интермедиатом видарабина аденинарабинозид-5'-трифосфатом.

Видарабин — эффективное средство лечения герпетических энцефалитов, существенно снижающее смертность больных. Галогенизированные производные. Для проявления антивирусного эффекта необходимо их метаболизирование до фосфорилированных нуклеотидов, подавляющих вирусные ДНК-полимеразы.

Идоксуридин (5'-йодо-2'-дезоксиуридин, 5'-йододезоксиуридин, IUD) — первый и наиболее эффективный противовирусный препарат данной группы; фосфорилируется как клеточной, так и вирусспецифической тимидинкиназой, то есть его активная форма образуется как в заражённых, так и в интактных клетках. Применяют местно для лечения герпетических кератитов. Побочные эффекты препарата (подавление лейкопоэза) при системном применении ограничили возможность его широкого использования.

Трифторидин (вироптик). Степень селективного воздействия препарата на ДНК-содержащие вирусы (герпеса, оспы, аденовирусы) выше, чем идоксуридина, что обусловлено более высокой (в 15-20 раз) скоростью его фосфорилирования вирусспецифической тимидинкиназой.

Ацикловир — ациклический нуклеозидный аналог гуанозина с высокой избирательностью к инфицированным вирусами клеткам. В клетках происходит последовательное превращение ацикловира в моно-, ди- и трифосфат. Первый этап индуцирует вирусспецифическая тимидинкиназа, экспрессируемая в клетках вскоре после заражения; за реализацию остальных этапов фосфорилирования ответственны клеточные киназы. Образующийся ациклогуанозинтрифосфат ингибирует ДНК-полимеразу вирусов, тормозя образование полноценной молекулы нуклеиновой кислоты, так как из-за отсутствия гидроксильной группы к ациклогуанозинтрифосфату не могут присоединяться последующие нуклеотиды. Таким образом, препарат не влияет на синтез ДНК в незаражённых клетках, так как в них он не превращается в активную форму. Препарат эффективен при лечении инфекций, вызванных ВПГ. При инфекциях, вызванных другими герпесвирусами (например, ЦМВ или вирусом Эпстайна-Барр), этот препарат назначать нецелесообразно, так как названные возбудители лишены вирусспецифической тимидинкиназы.

Фамцинловир. Механизм действия фамцикловира аналогичен таковому ацикловира. Фармакокинетика препарата позволяет применять его с большими интервалами, и он вызывает меньше побочных эффектов.

Ганцикловир — производное ацикловира; активируется под действием киназ млекопитающих и вирусных фосфотрансфераз с образованием трифосфата, ингибирующего преимущественно ДНК-полимеразу ЦМВ.

Фоскарнет. Помимо подавления активности обратной транскриптазы, препарат ингибирует активность всех ДНК-полимераз герпесвирусов и вируса гепатита В. Механизм действия обусловлен связыванием полифосфатных групп ДНК-полимеразы, что препятствует поступлению пирофосфатов из дезоксирибонуклеозидтрифосфата и блокирует элонгацию молекулы ДНК. Аналогичный механизм заложен в ингибирование обратной транскриптазы, но препарат взаимодействует с ферментом через группировки, отличные от участвующих в связывании пирофосфатов.

Препараты этой группы ингибируют активность как РНК-, так и ДНК-полимераз вирусов. Среди большой группы соединений клиническое применение нашёл рибавирин. Этот аналог гуанозина проявляет антивирусную активность in vitro в отношении не менее чем 27 РНК- и | 12 ДНК-содержащих вирусов. Основные механизмы антивирусной активности:
• конкуренция с гуанозином за связь с ферментами, обеспечивающими образование ГТФ;
• ингибирование полимераз нуклеиновых кислот вирусов;
• нарушение кэпирования мРНК встраиванием метилированного гуанина в 5'-окончание молекулы РНК.

Ингибиторы протеаз представлены негидролизующимися синтетическими пептидами (препараты саквинавир, ритонавир, индинавир). Механизм действия связан с конкурентным ингибиро-ванием протеаз ВИЧ, что ведёт к подавлению дезинтеграции молекул полипротеинов. В результате в ВИЧ-инфицированных клетках накапливаются проявляющие цитотоксическое действие нерасщеплённые предшественники gag-полипротеина.

Ингибиторы сборки дочерних популяций представлены производными тиосемикарбазонов. Практическое применение нашёл N-метилизатин-р-тиосемикарбазон (метисазон). Антивирусное действие обусловлено подавлением синтеза поздних белков (точнее, синтеза поздних мРНК или поздних полисом), что нарушает сборку дочерних популяций.

 

Вопрос№48. Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии. Ретровирусные векторы Опыт клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусные векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Тем не менее безопасности их применения продолжают придавать большое значение. Создана конструкция, называемая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены gag и poh на­ходящиеся под контролем 5'-LTR-npoMOTopa, a также «терапевтический» ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. После трансфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц, причем вероятность рекомбинации с образованием компетентных по репликации ретровирусов очень мала. Вектор может переносить не более 3,5 т. п. н. ДНК, но и длина большинства потенциальных «терапевтических» кДНК и генов — супрессоров опухолей составляет 0,5—2 т. п. н.В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования: увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделяшиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр инфицируемых им клеток. Это явление называется фенотипическим смешиванием (pseudotype formation). Фенотипически смешанный вирус получают с помощью котрансфекции клеточной линии, которая синтезирует продукты генов gag и pol, рекомбинантным ретровирусным вектором и вектором, экспрессирующим ген env другого вируса. Изменяя ген env, можно как сузить спектр инфицируемых вирусом клеток до строго определенного типа, так и расширить его. Кроме того, в ген env ретровируса можно встроить нуклеотидную последовательность, кодирую­щую пептид, который связывается с определенным клеточным рецептором и обеспечивает внедрение рекомбинантного ретровируса в нужные клетки. И наконец, можно добиться специ­фичности экспрессии терапевтического гена, осуществляя ее под контролем промотора, специфичного для определенных клеток.

Аденовирусные векторы

Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки человека и широко используются в качестве жи­вых вакцин, которые предотвращают респираторные инфекции и гастроэнтериты, не оказывая побочного действия. Эти свойства делают аденовирусы перспективными для доставки генов в клетки-мишени.

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синте­зирующей продукты аденовирусного гена Е1, двумя участками генома аденовируса (рис. 21.7). Один из них может существовать в виде гатазмиды в Е. coli и содержит вместо Е1 -области «тера­певтический» ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5'-концевого участка, включающего El-область, и имеет перекрывающийся уча­сток с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо Е1-области находится терапевтический ген. Продукты гена Е1, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. В отсутствие рекомбинации трансфицирующие молекулы ДНК, обладающие недостаточной длиной, не могут упаковываться в вирусные частицы. Вероятность того, что между областью Е1 в геноме клетки-хозяина и ДНК рекомбинантного аденовируса произойдет рекомбинация с образованием компетентных по репликации вирусов, чрезвычайно мала.

После того как рекомбинантный аденовирус инфицирует клетку-мишень, его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия «терапевтического» гена. Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью.

Аденовирусные векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковис-цидоза.

Вирус SV40 (сокращение от Simian vacuolating virus 40) — полиомавирус, обнаруженный в клетках обезьяны и человека. Как и другие полиомавирусы, SV40 является ДНК-содержащим вирусом и может вызывать образование опухолей, но обычно находится в стадии латентной инфекции. Вирус SV40 имеет икосаэдрический вирион, содержащий геномную ДНК длиной около 5000 пар оснований. Вирион прикрепляется к рецепторам MHC класса 1 на поверхности клетки при помощи гликопротеина VP1. Внутри ядра клетки клеточная РНК полимераза II экспрессирует ранние гены. Транскрибированная мРНК подвергается разрезанию на два фрагмента, кодирующие большой и малый Т-антигены. Около 5 % большого Т антигена поступает в плазматическую мембрану клетки, а около 95 % поступает в ядро. В большой Т антиген связывается с тремя сайтами в вирусной ДНК, связывание с сайтом I и II регулирует синтез ранних РНК, связывание со вторым сайтом происходит в каждом клеточном цикле II. Связывание с сайтом I вызывает репликацию ДНК в месте ориджина репликации. Сборка вирионов осуществляется в ядре клетки.

Вопрос№49.Принципы картирования геномов вирусов. Физические и генетические карты. Тест рекомбинации применяют для генетических исследований вирусов. С его помощью возможно построение генетических карт вирусов, в которых определяется, в каких участках генома произошли мутации, а также в условных единицах измеряется расстояние между разными мутациями.Использование разных рестриктаз позволяет получать фрагменты разной величины, которые затем разделяются и анализируются путем электрофореза в агарозных или полиакриламидных гелях. Сочетание рестрикционного анализа с другими методами позволяет составить физические карты геномов вирусов. Физические карты вирусных геномов обозначают взаимное расположение генов, их границы, локализацию начала репликации, промоторов, лидеров, экзонов и интронов, сигнальных последовательностей и других генетических элементов.

Вопрос№50.Методы изучения взаимодействия вирусов с клетками (физические, биохимические, генетические). Биологические методы исследования основаны на биологических свойствах вируса (способности к гемагглютинации, гемолизе, ферментативной активности) и особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характере цитопатического эффекта, образовании внутриклеточных включений и т.д.). Для количественного учёта вируса и динамики его размножения применяют различные методы титрования. Важнейшие из них основаны на том, что вирус, размножаясь в клетках, вызывает видимые простым глазом поражения. Бактериальные вирусы (бактериофаги) титруют по числу стерильных пятен, вирусы растений — по числу некрозов на зараженном вирусом листе, вирусы животных и человека — по числу поражений на однослойных культурах тканей. Иммунологические методы исследования вирусов основаны на иммунологических процессах (взаимодействии антигена с антителами) и имеют исключительное значение, как для научных исследований, так и для диагностики вирусных заболеваний. Разнообразные иммунологические методы, как классические, так и современные (иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, иммунофлюоресценция), являются важнейшим инструментом вирусологии.С помощью биохимических методо в определяют химический состав вирионов.Для изучения вирусов используются также разнообразные физико-химические методы. Ультацентрифугирование позволяет сконцентрировать вирусные препараты и определить массу вирусных частиц, градиентное центрифугирование в растворах сахарозы или солей металлов дает возможность "рассортировать" вирусные частицы, так как даже при незначительном различии их веса они распределяются слоями на разных уровнях раствора. Применение радиоактивных изотопов позволяет проследить, из каких источников черпает вирус вещества для построения вириона. Для определения концентрации вирусных препаратов и изучения особенностей строения вирусных частиц применяют оптические методы. Электронная микроскопия позволяет увидеть вирусные частицы в препаратах и в тканях. Для изучения вирусных структур используется рентгеноструктурный анализ.Современная вирусология использует все методы молекулярной биологии – бесклеточные системы синтеза белка и нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, молекулярную гибридизацию, генную инженерию, искусственную экспрессию и нокаут генов, и т.д.Неотъемлемой частью современных методов является компьютерный анализ.

Вирусологические методы исследования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции. Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д. Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др. Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител. Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др. Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях: реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Вопрос№51. Особенности строения и репликации ретровирусов. Важнейшие представители ретровирусов. Репродукция начинается с ассоциации комплекса молекулы тРНК, фермента обратной транскриптазы и геномной РНК.Синтез однонитевой копии ДНК на РНК матрице.обеспечиваемые обратным транскриптом, синтезируются однонитевые ДНК, которые находятся во временной ассоциации за счет водородных связей с матричной молекулой биномной нити РНК вируса(+ нить)Следующий этап – деградация нити РНК из этого гибридного комплекса РНК ДНК, за счет РНКазной активности фермента обратной транскриптазы, причем эта РНКазная активность реализуется только в отношении гибрида ДНК - РНК (когда одна нить представлении ДНК, другая РНК) и съедается только РНК. На другие свободные РНК это фермент не действует. Затем, после дегдарадации РНК нити, на синтезированной нити ДНК достраиваются комплемент нить ДНК, за счет чего формируется двунитевый продукт обратной транскриптазы - двунитевая молекула ДНК, представляющая собой копию вирусного бинома(+РНК), причем эта двунитевая молекула замыкается в кольцо и этот весь процесс осуществляется в цитоплазме; затем эта кольцевая молекула ДНК, тобишь вирусный ДНК интермедиат, транслоцируется в клеточное ядро, где встраиваются в геном клетки хозяина в неопределенных неспецифических местах. Это говорит о том, что для встраивания данной ДНК не требуется обширная генетическая гомология, достаточно несколько пар гомологичных нуклеотидов, чтобы произошел одиночный кроссингов и кольцевая молекула интермидиат вирусной ДНК встроится в хромосому клетки. Встроившаяся ДНК копия вирусного генома по сути дела представляет ген клетки, и в этом интегрированном состоянии может находиться длительно время. При транскрипции клеточного генома РНК -полимеразами (РНК-полим 2)возникают продукты в виде РНК, но это уже не иРНК клетки, а геномное рнк ретровируса. Т.Е, ДНК интермедиата снимается или копируется в биномные РНК ретровируса, которые участвуют и в процессе транляции и в формировании вирусного потомства. В процессе транскрипции ДНКинтермедита формируются иРНК разной длины ибо транскрипция начинает с разных рамок считывания. Формируются вирусные Белки, необходимые для построения оболочек ретровирусов. Каким образом эти вирусы вызывают развитие раковых опухолей.Один из ретровирусов явился первым опухолевым вирусом, обнаруженным эксперементально в 1911.Родительсткая геномная ДНК с одной нитью. В составе вириона имеются ферменты - обратная транскриптаза и еще некоторые ферменты: тимиденкиназа и многие другие, а так же тРНК. Происходит копирование в кольцевую молекулу двунитевой ДНК, которая встраивается в хромосомы клетки в виде, по выражению Холагда Темина- протовируса. Таким образом, в клетки присутствует генетическая информация ретровирусов в виде последовательности ДНК. При транскрипции этой области в хромосоме,синтезируются несколько типов иРНК (короткие молекулы), которые транслируются в белки, участвующие в процессе сборки зрелых частиц, и способствуют геномной РНК - потомство ретровируса. При транскрипции протовируса возникают два типа РНК: РНК - геномное и РНК - информационное, комбинирующая синтез вирусных белков. Вирус собирается и высвобождается из клекти в процессе отпочковывания.

Вопрос№52.Очистка бактериофага. Получение чистых линий. На практике при получении мутантов, генетическом анализе и т. п. часто приходится выделять чистые линии бактериофагов, представляющих собой потомство одной фаговой частицы. Существуют приемы, позволяющие произвести выделение чистых линий бактериофагов с минимальными затратами питательных сред и времени. Техника получения чистых линий фагов. Смесь Т-четных и Т-нечетных бактериофагов, образующих крупные и мелкие негативные колонии, высевают на газон бактерий Е. coli В. Для этого в полужидкий 0,7%-й расплавленный агар вносят 0,2 мл культуры бактерий, перемешивают и наслаивают в чашки Петри на поверхность 1,5%-го питательного агара. Чашки подсушивают, затем полоски стерильной фильтровальной бумаги обмакивают в смесь бактериофагов и проводят ими параллельные линии по газону бактериальной культуры (сверху вниз, до 10 линий на чашку). Чашки помещают в термостат с температурой 37°С. В местах нанесения фага будут видны зоны лизиса бактериальной культуры, при­чем на первых полосах - более выраженный лизис, а на последних - отдельные негативные колонии фагов. Отмечают две изолированные колонии (крупную и мелкую) и с помощью бактериологической петли переносят каждую вместе с агаром в отдельную пробирку с 1 мл бульона. Из каждой пробирки стерильной бумажной полоской производят рассев фага на газон чувствительных бактерий. Чашки инкубируют при температуре 37 °С. Убеждаются, что после расчистки на каждой чашке формируются негативные колонии одного типа, в противном случае процедуру расчистки повторяют.Линия фага считается чистой, когда однородные негативные колонии фага образуются на протяжении не менее 5 пассажей.

Вопрос№53. Особенности репликации вируса гепатита В. Вирионы гепатита В (частицы Дейна) сферической формы с диаметром 42—45 нм. Они состоят из сердцевины диаметром 27 нм, содержащей вирусную двунитчатую кольцевую ДНК, окруженную мембраной толщиной 2 нм; сердцевина окружена внешней липопротеидной оболочкой толщиной 7 нм. Наряду с полноценными вирионами встречаются в гораздо большем количестве частицы, состоящие лишь из фрагментов наружной оболочки. Они могут быть сферическими с диаметром 16—25 нм и нитевидными с диаметром 10—20 нм и длиной до 700 нм. Нитевидные структуры являются агрегатами сферических частиц. Частицы содержат поверхностный антиген вируса — HBs-антиген и накапливаются в результате избыточной продукции поверхностного компонента частиц Дейна. Частицы HBs антигена не обладают инфекционной активностью, однако, они являют­ся маркером на возможное присутствие частиц Дейна в исследуемом материале.Гепатит В (гепадновирус) - подгруппа ДНК-содержащих вирусов, содержащих двунитевую ДНК.Геном данного вируса представлен кольцевой молекулой ДНК, которая не является ковалентонозамкнутой молекулой ДНК, а имеется линкер, обеспечивающий закольцовывание. Причём одна из нитей имеет разрывы, т.е. несплошная, и стабилизация всей геномной молекулы обеспечивается второй нитью, которая не имеет разрывов. В составе вирусной частицы вируса гепатита В имеется фермент- ДНК-полимераза, которая обеспечивает достраивание разодранной нити до цельной нити и формирование двунитевой молекулы ДНК, которая транскрибируется с образованием РНК-продуктов двух типов:РНК одного класса служит в качестве иРНК для синтеза соответствующих белков;РНК второго класса представляет собой своеобразные РНК-матрицы для синтеза геномной ДНК вируса гепатита В. Причём этот синтез геномной ДНК вируса гепатита В на РНК-матрице осуществляется обратной транскриптазой. (вирус гепатита В является предраковым – рак печени).Геном вируса гепатита В не встраивается в генном клетки и в,, отличие от ретровирусов не проходит стадию интермедиата ДНК в процессе репродукции. Если обнаруживаются в геноме клетки фрагменты генома вируса гепатита В, то эта ситуация является инициирующей для процесса превращения клетки в злокачественную. С этим связана онкогенная функция гепатита В.Схема репродукции вируса гепатита Б (гепабновирусы).Родительская геномная ДНК вируса имеет разрывы в одной нити, вторая нить стабилизирует эти структуры. Полимеризующие ферменты вириона на первых этапах репродукции обеспечивают заделывание этих брешей(репарацию) и превращение в двунитевую структуру молекулы ДНК. Эта молекула транскрибируется и возникает 2 класса РНК:Первый класс – это «+» иРНК транслируется в белки, среди которых обратная транскриптапза, полимераза, специфическая иРНК(?), которая участвует в репликации ДНК. РНК второго класса, возникающая при транскрипции,является матрицей для синтеза с помощью обратной транскриптазы двунитевой геномной ДНК, включающаяся вместе со структурными белками в образование зрелого потомства. В природе существует генно-инженерная вакцина против гепатита В, созданная по технологиям рекомбинатных ДНК. Автор вакцины – сэр Кент Мурей.

Вопрос№54. Бакуловирусы насекомых. Особенности их репликации и использование в качестве векторов экспрессии в биотехнологии. Вирионы бакуловирусов представляют собой палочковидные нуклеокаспиды. Заключённые в липопротеиновую оболочку. Геном представлен двуцепочечной ДНК, размером до 160 тпн. Группа бакуловирусов подразделяется на субгруппы, 2 из которых формируют большие белковые кристаллы, куда упаковываются их вирионы. Данные кристаллы носят название – тела включения.

Субгруппа А – вирусы ядерного полиэдроза (NPV): образуют в ядре клетки полиэдры.

Субгруппа B – вирусы гранулёза(GV): в цитоплазме образуются кристаллические включенияв виде овальных гранул. В каждой грануле как правило 1 вирион.

Субгруппа С – не образуют тел включений.

Заражение происходит путём поедания белковых кристаллов насекомыми. Кристаллы растворяются в щелочной среде средней кишки, что провоцирует заражение. Первоначальные вирионы инфицируют клетки эпителия кишечника, где формируются свободные вирионы, которые затем попав в гемолимфу, разносятся по тканям организма, где и формируют впоследствии тела включения.Интерес вызывают механизмы, которые контролируют синтез большого количества полиэдрина или гранулина. (25% суммарного белка клетки) Такой синтез указывает на высокое содержание мРНК белков вируса в клетке. А такое количество мРНК говорит о силе промотора.