Методы изучения морфологии вирусов. Выделение. Концентрация. Очистка в. частиц.

1. Ульрафильтрация

2. Методы фракционирования

3. Хроматографичкеские м.

4. М. центрифугирования

5. М., основанные на светорассеянии цвета

6. М. электрической микроскопии

7. М. структурного анализа

 

Для изучения физ-хим методов необходимо выделять в. частицы в достаточном кол-ве, сконцентрировать и очистить.

Многие методы основаны на обычных классических м. выделения и очистки белков.

Источники для выдел. в. материала:

- чел и жив: ткани, органы, т. жидкости, эксуданты, кл культура ткани

- фитовирусы: клетки растительной ткани

- бактерий: культуральная жидкость, суспензия с клетками

Разрушают м. ультразвуковой десинтеграции, прессгомогенизации (продавливание замороденной суспензии через пресс или растирание). Все эти м. при низкой температуре (чтобы не было активации в. частиц).

В дальнейшем проводят концентрирование, очистку, фракционирование. Кроме классич м. очистки белковых компонентов используются спец м.:

27. Метод ультрафильтрации – пропускание жидкости через пористый материал. Типы: нативные, твердые, полутвердые, мягкие

- нативные – состоят из песка, азбеста, талька, коалина, фосфорнокислого кальция

- твердые – форма полого цилиндра, испол коалин – это водный раствор алюмосиликата с примесью кварцевого песка, разная степень пористости, испол в начальных этапах фильтрации, 1- свечи Беркефельда (недостаток неоднородность пор) 2- свечи Шамберлена

- полутвердые – в основе прессованный асбест, впервые получены в 1918, простые, дешевые, недостаток (одноразовые)

- мягкие – из колодия, агар-агара, целлюлоза, желатина, нитрацеллюлоза добавляют глицерин, метиловый спирт, молоч кислоту

На твердой основе – коалиновые свечи, используют пластинчатые фильтры состоящии из целлюлозы или нитрацеллюлозы. Изготовляют с заранее заданным размером пор – градопориевые фильтры – можно определить размеры в. частиц

Для изучения размера вир частиц:

М воздушного давления

М стандартных золей

М измерения пористости пор – по скорости прохождения через фильтр определенного обьема жидкости

Параметры прохождения в. частичек:

- адсорбция (наибольшей адсорб обладают асбестовые фильтры),

- эл заряд частичек,

- заряд фильтра (полож заряженные фильтры полностью задерживают фаги),

- рН фильтрируемой жидкости (рН должно быть выше 7) и ее вякость (польматация – закупорка пор слизью, вяжущие вещ-ва)

61. М. фракционирования и осаждения в. частиц – когда необходимо выделить в. из большого обьема жидкости. Необходимо учитывать: концентрацию солей, изоэлектр точка, рН среды

 

Высаливание – испол сернокислый аммоний ((NH4)2SO4) – он не вызывает денатурацию, растворимость независит от температуры

Подбирается рН среды и температурный режим. Используются ступенчатые фракции сернокислого аммония: 10, 20, редко 25, 100

 

Дализ (очищение вир частичек от солей) изоэл точ = 0

 

Фракционирование – испол органические растворители (ацетон, этанол). При низких температурах. Достоинство м: быстрота удаления орг растворителей. Происходит в 2-х фазных ситемах: водные растворы полиэтиленгликоля и декстрана. Достоинство: разделение в мягких условиях (низк темпер), высокая эффективность, орг полимеры оказывают стабилизирующие действие на структуру в. частиц. Испол делительные воронки, полиэтиленгликоль, натирй-сульфат декстран – растворенный в 0,3 М р=ре хлористого натрия.

Таким м очищены Тчетные фаги

Способы фракционирования:

1 отделяют нижнюю фазу и воспроизводят в ней первоначальную 2-х фазную систему, и так опять взбалтывается

2. отделяют нижнюю фазу и добавляют полимер верх фазы и концентрируют, т. е. происходит поочередное концентрирование в верх и в ниж фазе. Достоинства: сохранение биологич активности, простота и быстрота метода, стерильность выделений, не образуется плотного остатка, что не инактивирует в. частицы.

 

Хроматографические методы

- адсорбционная

- противоточная

- Газово-жидкостная

- Ионно-обменная

- Проникающая

- аффинная

Проникающая– устанавливается равновесие между жидкой фазой на внеш и внутр поверхностях структуры. Разделение основывается на св-вах орг полимеров с трехмерной сетчатой структурой – гель-фильтрация. Испол хроматографическая колонка заполненная набухающим гелем, уравновешивается растворителем: проходят крупные в. частички, мелкие задерживаются. Для этих целей испол декстраны с поперечными сшивками- сефадексы, или агарозные гели (Биогель А, биогель Р). Декстраны сшиваются эпихлордегидрином, он не растворяется в воде но обладает гидрофильными свойствами, в зависимости от количества поперечных сшивок – они имеют степень пористости, т. е. можно определить молек массу в. частичек.

Аффинная – равновесие связей между макро- и микромолекулами как следствие биологическое сродство.Основана на биологической специфичности (субстрат-фермент, ингибитор-антитело)

Методы электрофореза

Испол для характеристики величины, формы, заряда в. частиц. В. за счет диссоциации аминокислотных групп белков капсидного слоя имеют заряд (больше кислых групп). Изоэлектрическая активность в основном определяется поверхностными белками

 

38. Методы ультрацентрифугирования Позволяет определить молекулярную массу, размеры вириона. Основан на анализе скорости движения суспензиирующей жидкости. 1925- Сведберг создал 1-ю центрифугу, ультрацентрифугирование до 500 000 g (скорость ускорения).

1. м. скорости седиментации

2. м. седиментационного равновесия

3. м. ультрацентрифугирования в градиенте плотности

М. скорости седиментации при достаточном ускорении поля тяготения скорость седиментации превышает диффузию частиц в растворители, частицы отделяются от растворителя и за границей раздела можно наблюдать с помощью определенных оптических приспособлений. Скорость седиментации выражается через коэффициент седиментации. Измеряется в единицах Сведберга 1 ед. Св=10^-13с

МЕТОД СЕДИМЕНТАЦИОННОГО РАВНОВЕСИЯ

Результаты не зависят от формы частичек, седиментация = диффузия, при длительном не быстром ультрацентрифугировании. Вдоль центрифужной пробирки устанавливается градиент концентрации частиц, частицы должны быть гомогенны, измеряя концентрацию частиц на различных расстояниях от оси вращения вычисляется молекулярный вес частиц.

МЕТОД УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ. Используются инертные вещества – сахароза. Определяется константа седиментации для разделения частиц. Создается определенный градиент плотности, наслаивается на поверхность растворитель с исследуемым веществом, при определенной константе седиментации сравниваем с белками-летчиками сравнивается с вирусными частицами. Частицы с различной молекулярной массой распределяется в различных зонах градиента плотности.

ИЗОПЕКНИЧЕСКИЙ МЕТОД. С использованием солевых растворов высокой плотности (6М раствор хлористого цезия). Хлористый цезий седиминтируя создает устойчивый градиент, в ходе центрифугирвания частицы концентрируются в определенной зоне соответствий плотности. Т.е. основано на различии разделения вирусных частиц, в их плавучей плотности. Извлечение путем вытеснения (прокалывается дно пробирки и фракция вытеснения используется КОРЕКТОР). Этот метод позволяет определить относительное содержание белка и нуклеиновых кислот.