Непрямое действие ионизирующих излучений на молекулы

 

При облучении растворов молекул, наряду инактивацией макромолекул за счет прямого попадания на них квантов или частиц, имеет место и инактивация молекул в результате косвенного действия радиации. Косвенное действие обуславливается, в первую очередь, взаимодействием растворенных молекул с продуктами радиационного распада молекул растворителя. В этом случае макромолекулы испытывают дополнительное воздействие и эффективность их поражения значительно выше, чем в сухих препаратах. На рисунке 5 показана радиочувствительность лиофилизированного препарата РНК-азы и молекул в водном растворе. Как видно, растворение фермента приводит к повышению его радиочувствительности в сотни раз. Так, D₃₇ для сухого препарата составляет 420 кГр, а в растворе этот показатель равняется всего лишь 4 кГр, т.е. радиоустойчивость молекул в водном растворе снижается более чем в 100 раз по сравнению с лиофилизированными молекулами. Снижение радиоустойчивости в десятки и сотни раз при растворении молекул экспериментально показано для многих представителей белков, НК. Выявлено, что причина снижения устойчивости в водных растворах связана не с изменением физико-химических свойств макромолекул в результате растворения, а с появлением в облученном растворе дополнительных поражающих факторов, в первую очередь, продуктов радиационного распада (радиолиза) воды. Рассмотрим тот процесс более подробно.

 

Радиолиз воды

Под термином «радиолиз воды» понимают разложение молекул воды при действии ионизирующей радиации с образованием ионов и свободных радикалов. Подсчитано, что основная часть (до 90 %) косвенного действия облучения на живые клетки обуславливается взаимодействием макромолекул с продуктами радиолиза воды.

Первый акт ионизации молекулы воды заключается в выбивании электрона с электронной оболочки с образованием катиона воды

H₂O ® H₂O* ® H₂O⁺ + e^-

Ионизированная молекула воды реагирует с другой нейтральной молекулой:

H₂O⁺ + H₂O ® H₃O⁺ + ОН^·

Свободный электрон также взаимодействует с нейтральной молекулой воды:

e^- + H₂O ® H₂O^- ® Н^· + ОН^·

 

Н^·, ОН^· - свободные радикалы водорода и гидрооксила. Свободными радикалами называют ионы с неспаренными электронами. Они характеризуются коротким временем жизни (t =10^-5 с) и высокой реакционной способностью. В растворах свободные радикалы реагируют с растворенными молекулами или рекомбинируют друг другом практически мгновенно. Если в облучаемом растворе присутствует кислород, образуются и другие продукты радиолиза, обладающие высокими окислительными свойствами:

Н^· + О₂ ® НО₂^·

 

НО₂^· -радикалы (гидропероксдные радикалы) могут рекомбинировать друг с другом с образованием перекиси водорода и свободного кислорода:

 

НО₂^·+ НО₂^· ® Н₂ О₂ + 2О

Кроме этих продуктов в процессе радиолиза возникает электроны в стабилизированном виде - гидратированные электроны (e^-_aq). Эти частицы характеризуются высокой восстановительной способностью и легко реагируют с различными молекулами. Еще одним хорошим восстановителем является атомарный водород, появляющийся при рекомбинации свободных радикалов водорода. Процесс радиолиза воды можно представить следующей схемой.

 

 

Реакции органических соединений с продуктами радиолиза воды

Образовавшиеся в процессе радиолиза продукты вступают в химические реакции с растворенными органическими молекулами: компонентами белков, НК, липидов, полисахаридов (аминокислотами, нуклеотидами, органическими кислотами, сахарами и т.д.).

Обозначим любую органическую молекулу символом RH, где H - реакционноспособный атом водорода, R - остальная часть органической молекулы. Рассмотрим основные типы реакций происходящих в облученных растворах органических соединений.

1. Отрыв атома водорода от молекулы при взаимодействии с радикалами Н^· и ОН^·:

R -H + ОН^· ® R^· + H₂O

R -H + Н^· ® R^· + H₂

2. Реакции диссоциации при взаимодействии аминокислот со свободными радикалами:

RNH₃⁺ + e^-_aq ® R^· + NH₃

RNH₂ + Н^· ® R^· + NH₃

3. Реакции присоединения в результате расщепления двойных связей:

R - CH = CН-R + ОН^· ® CH_2-R - COHR

 

 

Реакции радикалов органических молекул, приводящих к образованию стабильных соединений

1. Димеризация и присоединение.

Образовавшиеся свободные радикалы органических молекул могут взаимодействовать друг с другом, образуя димерные молекулы:

 

R₁^· + R₂^· ® R₁ ѕ R₂

R^· + R^· ® R ѕ R

В результате такого типа реакций появляются димеры молекул и агрегаты более высого порядка. Примером реакции димеризации является образование аминокислоты цистина при облучении раствора цистеина.

2. Реакции диспропорционирования

R^· + R^· ® RН + Р

В ходе такого типа реакции атом водорода перераспределяется между радикалми. В результате один из радикалов восстанавливается до исходной формы, а другой превращается в новое соединение. Например, при облучении раствора глицина возникает свободный радикал глицина:

NH₂CH₂COOH ® NH₂^·CHCOOH

Два радикала глицина вступают в реакцию диспропорционирования с образованием стабильных молекул аминокислоты глицина и имноуксусной кислоты:

NH₂^·CHCOOH + NH₂^·CHCOOH ® NH₂CH₂COOH + NH= CHCOOH

3. Реакции гидролиза

Взаимодействие органического свободного радикала с молекулой воды приводит к появлению стабильной молекулы:

R^· + Н₂О ® Р

Примером такой реакции является расщепление пептидной связи при облучении растворов белков:

-R₁СН₂ СО - NH CH₂R₂^· + Н₂О ® -R₁СН₂ СОOH + - NH₂ CH₂R₂

4. Присоединение кислорода

Как уже отмечалось, в присутствии свободного кислорода в облучаемых растворах образуются окислительные радикалы с высокой реакционной способностью:

Н^· + О₂ ® НО₂^·

e_q + Н⁺ + О₂ ® НО₂^·

Н₂О₂ + ОН^· ® Н₂О + НО₂

e_q + О₂ ® О₂^-

Как видно, в присутствии кислорода в облученных растворах возникают благоприятные условия для окисления. Свободные радикалы НО₂^· и О₂^- способны вызвать окисление органических соединений по любым связям, в том числе и тем, которые устойчивы в ходе обычных окислительно-восстановительных реакций. К числу наиболее характерных реакций органических соединений с радикалами НО₂^· относятся реакция образования гидроперикисей:

R^· + НО₂^· ® ROOH

Так, при облучении растворов образуются гидроперикиси аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот.

5. Реакции переноса водорода

Нейтрализация органических радикалов может происходить путем отнятия атома водорода у другого растворенного соединения:

R^· + Р - Н ® R - Н + Р^·

Наиболее распространенные реакции такого типа в растворах происходят с участием сульфгидрильных соединений. Например, свободный радикал метанола, образующийся при облучении растворов, нейтрализуется в присутствии SH- групп:

CH₃OH + OH^· ® H₂O + ^· CH₂OH,

^· CH₂OH + R - SH ® CH₃OH + RS

 

 

Инактивация молекул белков и НК в водных растворах

 

Существуют специальные методы, позволяющие выявить причинно-следственные связи между типом поражения молекул и наблюдаемым характером их инактивации. Как уже отмечалось, основными повреждающими агентами макромолекул при облучении живых клеток являются продукты радиолиза воды. С определенными макромолекулами взаимодействуют конкретные формы свободных радикалов. В растворе конкретные молекулы белков и НК многократно взаимодействуют со свободными радикалами, претерпевая различные повреждения. Однако не все структурные повреждения приводят к потере функциональной активности. Для определения конкретного типа радикала, ответственного за те или иные повреждения макромолекул, используют инактиваторы или перехватчики радикалов определенных типов. При использовании определенной комбинации перехватчиков в растворе можно инактивировать большую часть свободных радикалов, оставив реакционноспособным только радикалы одного типа. Другой прием для определения специфичности действия свободных радикалов состоит в том, что в растворе макромолекул специальными методами создают определенную концентрацию того или иного радикала и изучают протекающие реакции. Используя такие подходы, было изучено действие различных типов радикалов на растворенные молекулы белков и нуклеиновых кислот. В частности, обнаружено, что фермент лизоцим инактивируется в результате взаимодействия с радикалами ОН^·, e_q , Н^·. Инактивация трипсина происходит, в основном, за счет взаимодействия молекукл с радикалом ОН^·. Так, этиловый спирт - эффективный перехватчик радикалов ОН^· - блокирует инактивацию молекул трипсина в их присутствии. Зависимость между числом инактивированных молекул в водном растворе и дозой облучения носит тоже экспоненциальный характер. Как и в случае прямого действия, причина инактивации белковой молекулы является случайное событие попадания. В водном растворе инактивирующим событием (попаданием) может служить специфическая реакция свободного радикала с определенным участком молекулы. Например, причиной инактивации может быть частичная денатурация молекулы вследствие разрушения аминокислот, образующих дисульфидные, гидрофобные, водородные связи. Потеря ферментативной активности может наступить и в случае разрушения аминокислоты, входящей в состав активного центра фермента. Для выявления таких реакций и ее последствий используются различные методы определения физико-химических параметров макромолекул. Так, после облучения раствора рибонуклеазы в концентрации 1 мг/мл удается обнаружить различные изменения. В частности, увеличивается вязкость раствора, что свидетельствует о появлении агрегатов макромолекул. Образование агрегатов молекул можно определить и при помощи гельфильтрации (появляются новые фракции). Увеличение гидролитической активности протеиназ по отношению к облученному белку также свидетельствует об изменении конформации макромолекулы. Появление свободных SH -групп в растворе говорит о разрушении аминокислот цистеина, метионина. Такие нарушения структуры обнаруживаются при дозах равной D₃₇, когда каждая молекула испытывает в среднем по одному инактивирующему событию попадания.

При облучении раствора ДНК-азы обнаружено снижение количества остатков триптофана, который входит в состав активного центра фермента. Если на одну нативную молекулу фермента приходится в среднем 5 остатков триптофана, то после облучения в дозе близкой к D_37, определяется всего 3 остатка этой аминокислоты в расчете на одну молекулу. Разрушение триптофана вследствие ее взаимодействия со свободным радикалом приводит к резкому снижению активности ДНК-азы при облучении. В таблице 2 представлены данные о причинах инактивации некоторых ферментов при облучении их растворов.

 

Таблица 2

Предполагаемые причины инактивации ферментов облученных в водных растворах

(Окада, 1974)

 

Фермент	Причина инактивации при облучении
Рибонуклеаза Дезоксиробинуклеаза Фосфоглюкомутаза Каталаза   Фософоглицеридаль-дегиддегидрогеназа   АТФ-аза, сукцинат- оксидаза, глутамат- дегидрогеназа, лактат- дегидрогеназа, алка- гольдегидрогеназа	разрушение остатков метионина разрушение остатков триптофана разрушение остатков гистидина разрушение гемопорфириновой группы в ак- тивном центре фермента деструкция SH -групп цистеина и окисление SH -групп окисление и деструкция SH -групп

 

Анализ экспериментов с облучением белковых препаратов позволило выявить следующие типы повреждений этих молекул.

* Изменение аминокислотного состава.

* Нарушение высших (четвертичной, третичной и вторичной) структур молекул

* Возникновение разрывов полипептидной цепи.

* Появление агрегатов молекул с высокими молекулярными массами.

* Разрыв SH-связей и возникновение свободных SH- групп

* Разрушение аминокислотных остатков.

 

Большое число исследований посвящено выяснению механизмов поражения молекул нуклеиновых кислот в водных растворах. При помощи методов седиментации, хроматографии, электрофореза зарегистрированы появление поперечных сшивок и одиночных разрывов полинуклеотидных цепей в растворах ДНК после облучения. Показано, что возникновение однонитевых разрывов связано с повреждением азотистых оснований вследствие их взаимодействия с радикалами ОН^· Потеря инфекционной активности ДНК фага j 29 происходит в результате двухнитевых разрывов цепи. Вероятность появления двухнитевых разрывов пропорционально дозе облучения. Двухнитевые разрывы в молекуле ДНК появляются в результате накопления одиночных разрывов, т.е. при совпадении близкорасположенных разрывов в каждой цепи.

Расчеты показывают, что уже при поглощенной дозе 1 Гр в каждой клетке человеческого организма повреждается до 5000, что приводит к возникновению около 1000 одиночных и до 100 двойных разрывов нуклеотидов в молекулах ДНК.

Схематично представить процессы, происходящие в облученных клетках и живых организмах можно следующим образом:

Молекулы, атомы ® ионы, свободные радикалы ® изменения в органических молекулах ® радиобиологический эффект (например, мутация, болезнь, гибель).

Конечный (радиобиологический) эффект зависит от типа и дозы, от условий облучения и от свойств облучаемого ионизирующего излучения, объекта.

 

 

Вопросы и задания.

1. За счет какого механизма (прямого или косвенного) происходит инактивация рибулозадифосфаткарбоксилазы листьев при облучении растений γ- излучением.

2. Опишите, какие повреждения структуры молекул могут возникать при облучении рентгеновскими лучами: а) лиофильного высушенного препарата ДНК б) водного раствора ДНК.

3. При облучении тканей происходит нарушение специфических свойств и функций биологических мембран, в частности нарушается избирательная проницаемость клеточной мембраны. Какие изменения в структуре мембран приводят нарушению функций мембран?

4. Чем Вы объсните неодинаковую радиочувствительность различных ферментов? Дайте объяснения данным, приведенным на рис.3.

5. Какие методы можно использовать для определения радиочувствительности молекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов?

6. Почему при растворении кристаллов трипсина в буфере, радиочувствительность молекул повышается в десятки и сотни раз?

7. Опишите физико-химические процессы, происходящие при облучении дистиллированной воды.

8. Какие типы реакций могут иметь место при облучении а) раствора уксусной кислоты; б) раствора олеиновой кислоты; в) раствора глицина; г) раствора белка; д) раствора ДНК.

9. Будут ли одинаковы велечины LD_50, для молекул фермента в растворенном состоянии, в среде с кислородом и в среде без свободного кислорода.

10. Опишите схематично процессы, происходящие при облучении живых организмов ионизирующими излучениями.

 

 

Задачи.

1. Рассчитайте величину поглощенной дозы при инактивации 50 % молекул, если число мишеней равно 1.

2. Постройте дозовую кривую инактивации фермента по следующим данным: LD₁₀₀ = 500 Гр, LD₇₅ = 450, LD₅₀ =300 Гр, LD₃₇ = 180 Гр.

3. При облучении раствора ДНК было повреждено 300 азотистых оснований, что составило 10 % от количества азотистых оснований в одиночной цепи ДНК. Рассчитайте молекулярную массу облучаемой молекулы ДНК.

4. При какой дозе облучения инактивруется 80 % молекул РНК-азы (по данным рис. 3)

5. Во сколько раз снижается активность химотрипсина при повышении поглощенной дозы от 100 до 1000 Гр (по данным рис. 3).

 

 

Лекция 7. Действие ионизирующих излучений на клетку. Радиочувствительность клеток.

 

Любой радиобиологическийх эффект, проявляющийся на уровне органа и целого организма, возникает на клеточном уровне. Экспериментально показано, что облучение может повреждать все внутриклеточные структуры. Реакции на облучение на клеточном уровне могут проявляться в разнообразной форме: от незначительного повреждения отдельной структуры клетки до полной деградации и лизиса клетки. Степень выраженности клеточных реакций на облучение зависит, в большей степени, от количества поглощенной энергии (дозыионизирующего излучения), в меньшей степени, от генетической конституции и физиологического состояния клетки. Как известно, жизнь клетки между двумя последовательными делениями (от деления до деления) называют интерфазой. Условно интерфаза подразделяется на три периода: синтетический или S-период, в течение которого происходит синтез (удвоение) ДНК, предсинтетический G₁- период и постсинтетический G₂ –период. Митоз (деление соматических клеток) обозначают символом М. Продолжительность различных периодов клеточного цикла у разных клеток неодинакова. Как правило, для большинства типов клеток, по продолжительности различные клеточные фазы, располагаются следующим образом: М < G₂ < S < G_1. Абсолютная продолжительность периодов зависит от типа клеток. В малообновляющихся тканях млекопитающих (например, в нервной ткани) большинство клеток находится в G₁- периоде в течение длительного промежутка времени, от нескольких месяцев до нескольких десятков лет. Тогда как клетки регенерирующих тканей, например, клетки крипт кишечного эпителия человека делятся в среднем через каждые 20 часов (G₁-период занимает 10 ч, S-период - 8 ч, G₂ -период и митоз - 2 ч).

Часть лучевых повреждений могут легко переноситься клеткой, так как они являются повреждениями множественных структур, утрата которых быстро восстанавливается. Легко переносимые и быстро восстанавливающиеся повреждения клетки, проявляются в виде физиологических или кумулятивных эффектов (реакций). К таким повреждениям относятся, например, нарушения структуры отдельных макромолекул, отдельных органоидов, незначительные нарушения в структуре плазмалеммы. Такие структурные изменения могут выхзвать нарушения отдельных стадий метаболизма клетки, например, инактивацию ферментов, нарушения окислительного фосфорилирования в митохондриях, нарушения обмена белков, НК, углеводов и т. д. Как правило, эти реакции проявляются сразу после облучения и с течением определенного промежутка времени исчезают. Наиболее универсальной физиологической хорошо изученной реакцией клетки на облучение является временная задержка процесса клеточного деления (радиационное блокирование митоза). Суть ее состоит в том, что интерфазная клетка, облученная в определенной дозе, не начинает делиться в ожидаемый момент, а приступает к делению через определенный промежуток времени.Эта реакция является универсальной, т.е. проявляется у различных типов клеток всех живых организмов. Задержка клеточного деления хорошо изучена и в количественном отношении на клетках различных групп живых организмов. Выраженность и продолжительность времени задержки клеточного деления зависит от дозы ионизирующего излучения, от типа клетки и от того, на какой стадии клеточного цикла произошло облучение. Наибольший эффект наблюдается при облучении клеток находящихся в S-периоде и G₂ –периоде. Судьба облученных клеток после задержки деления может быть различной, она также зависит от величины поглощенной дозы. Большая часть облученных клеток после задержки деления проходит митоз и делится. Часть из них после этого гибнет, еще больше клеток гибнут после второго, третьего и последующих делений. Часть облученных клеток и их потомков, вступив в митоз, не способны разделиться. В результате возникают так называемые гигантские клетки, по своим размерам в десятки и сотни раз больше нормальных клеток.

Длительность задержки клеточного деления зависит от поглощенной дозы излучения: чем выше доза, тем больше время задержки деления. В результате проведения многочисленных экспериментов установлено, что для большинства изученных типов клеток, время задержки деления составляет примерно 1 час на каждый 1 Зиверт эквивалентной дозы. Таким образом, универсальность этой реакции клеток на облучение проявляется и в количественном отношении. Необходимо отметить, что с увеличением дозы излучения возрастает не доля прореагировавших клеток, а продолжительность времени задержки деления каждой клетки. В этом состоит принципиальное различие физиологических эффектов облучения от летальных поражений клеток. Продолжительность задержки клеточного деления зависит и от стадии клеточного цикла, на которой находилась облученная клетка. Наиболее длительно время задержки при облучении клеток в S-периоде и G₂ –периоде, самое короткое – при облучении в митозе. Большинство клеток, вступивших в митоз, даже при облучении очень высокими дозами, заканчивают деление без задержки.

Молекулярные механизмы, ответственные за задержку клеточного деления, пока не известны и они активно обсуждаются. Многие исследователи связывают торможение митозов с подавлением синтеза ДНК. Однако, экспериментальные данные свидетельствуют, что снижение содержания ДНК в клетках является не причиной, а следствием задержки деления. Предполагается, что блокирование митозов вызывается повреждением внутриклеточных структур, ответственных за регуляцию процесса деления ядра и клетки. По-видимому, задержка клеточного деления не является специфическим ответом на действие ионизирующего излучения, а представляет универсальный защитный механизм организма на любые внешние воздействия. Задержка клеточного деления реакция наблюдается и при действии на организм или на культуру клеток других физических и химических факторов.

Задержку клеточного деления на определенное время необходимо отличать от полного подавления митозов при высоких дозах облучения, когда клетка в течение значительного промежутка времени продолжает функционировать, но необратимо утрачивает способность к делению. Интервал доз, в котором происходит временная задержка деления клеток, зависит радиочувствительности организма и от типа облучаемых клеток. Так, для большинства типов делящихся клеток млекопитающих этот интервал находится в пределах от 0 до 10 Зв.

 

Летальные реакции клеток. Формы клеточной гибели при облучении.

 

В радиобиологии принято различать две формы гибели клеток: репродуктивную и интерфазную гибель. Под репродуктивной гибелью подразумевается утрата клеткой способности к неограниченному размножению (пролиферации), т.е. к образованию клона. Репродуктивная гибель клеток заключается в необратимой потере способности к делению, облученными клетками или их потомками. Репродуктивная гибель клеток имеет место при относительно невысоких дозах облучения. Этот радиобиологический эффект хорошо изучен количественными методами на различных типах клеток. Репродуктивная гибель делящихся клеток происходит не сразу после облучения, а постепенно, в процессе нескольких циклов деления. Так показано, что при облучении культуры фибробластов мышей в дозе 4 Гр, около 80 % клеток заканчивали 1 деление, а второе и третье деление завершали только 30 % начавшихся делиться клеток. Репродуктивная гибель клеток проявляется в образовании гигантских клеток в результате слияния нескольких клеток или при длительной задержке цитокинеза.

Вторая форма радиационной гибели клеток - интерфазная гибель - наступает при облучении клеток высокими дозами радиации. Интерфазная гибель клетки обуславливается появлением в ее структуре значительных нарушений, после которых она теряет способность к функционированию как живая система. При очень высоких поглощенных дозах (сотни и тысячи Грей) гибель клеток наступает мгновенно или вскоре после облучения. В диапазоне небольших доз (до 10 Гр для клеток млекопитающих) гибель клеток наступает в первые часы после облучения. Интерфазную гибель клеток можно зарегистрировать цитологическими методами: на препаратах облученных клеток хорошо видны различные дегенеративные изменения в структуре (лизис ядра, разрывы мембран, хромосомные аберрации). У мертвых клеток изменяются биохимические и физиологические параметры: теряется избирательная проницаемость плазмалеммы, активируются гидролитические ферменты, подавляется процесс клеточного дыхания. Одним из универсальных показателей интерфазной гибели клеток является окрашиваемость цитоаплазмы клеток различными красителями. Окрашивание цитоплазмы связано с потерей избирательной проницаемости клеточной мембраны, и неспособностью мертвой клетки удалять из цитоплазмы красители.

При анализе облученной популяции клеток, можно руководствоваться следующей закономерностью: чем выше поглощенная доза и радиочувствительность клеток, тем выше вероятность интерфазной гибели этих клеток.

Детальные механизмы, вызывающие репродуктивную и интерфазную гибель клеток остаются пока невыясненными. Предполагается, что основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения молекул нуклеиновых кислот, в первую очередь, хромосомной ДНК. Такие повреждения легко обнаруживаются цитологическими методами в виде различных хромосомных перестроек (аберраций). Основными типами таких аберраций являются фрагментация хромосом, образование различных межхромосомных стяжек, появление кольцевых хромосом, внутри и межхромосомный обмен участками. Аберрации нарушают процесс деления ядра и клетки, приводят к частичной утрате генетического материала и клетка гибнет из-за неспособности синтезировать белковые молекулы.

Интерфазная гибель клеток наступает вследствие многочисленных структурных нарушений, в первую очередь нарушений в структуре мембран, приводящей к потере клеточного гомеостаза. Предполагается, в интерфазной гибели клеток большую роль играют гидролитические ферменты, которые расщепляют молекулы белков и нуклеиновых кислот. Более подробно механизмы клеточной гибели будут рассмотрены ниже.

 

 

Оценка клеточной радиочувствительности. Кривые выживания.

Для определения количества живых клеток после облучения используют способность живых клеток к неограниченному размножению, вследствие чего одиночные клетки образуют колонии или так называемые «бляшки» на поверхности питательных сред. Рассмотрим некоторые классические опыты, которые явились основой для создания методов, используемых для количественной оценки радиочувствительности клеточных культур. Впервые количественнй метод для определения выживаемости клеток был разработан в 1965 году Г.Паком и П. Маркусом на культуре клеток HeLa. Суть этого метода заключается в следующем. Определенное количество культуральных клеток высевают на твердую питательную среду в чашках Петри. После этого чашки с клетками облучают различными дозами радиации и инкубируют в оптимальных, для роста этих клеток, условиях. Через определенный промежуток времени подсчитывают число образовавшихся колоний на поверхности питательной среды. Выживаемость клеток при определенной дозе облучения определяют как отношение числа колоний выросших в облученных чашках, к числу колоний в контрольной чашке Петри (без облучения). Этот метод и в настоящее время широко используется для оценки радичувствительности клеток in vitro.

Другой метод определения выживаемости клеток in vivo (в организме) был предложен в 1961 году Дж. Тилл и Е. Мак-Кулох. Клетки костного мозга, печени или селезенки вводят в вену летально облученных мышей. Через неделю на селезенке мышей появляются колонии, состоящие из потомства введенных клеток. Число колоний, образующихся на селезенке, показывает пролиферативную (клоногенную) способность введенных клеток. Эта способность зависит от дозы облучения вводимых клеток. Путем сравнения числа колоний, полученных от облученных в различных дозах клеток, и числа колоний на селезенках контрольных мышей (с клетками без облучения), получают кривые, описывающие зависимость доза-эффект, или кривые выживания.

Современные технологии выращивания культур клеток и тканей позволяют экспериментаторам оценить in vitro радиочувствительность любых типов клеток микроорганизмов, растений и животных.

 

Кривые выживания клеток

 

Кривой выживания называют кривую, описывающую зависимость количества выживших клеток, организмов от дозы облучения. Кривая выживания представляет кривую «доза-эффект», когда критерием радиобиологического эффекта является смерть клетки. Как уже отмечалось, кривые «доза-эффект» имеют экспоненциальный характер. Кривые выживания, полученные опытным путем на различных типах клеток, отличаются от теоретических ожидаемых кривых. Они также отличаются и от классических дозовых кривых, полученных в экспериментах с макромолекулами. Кривые выживания описываются уравнением

N/ N₀ = 1 - (1- e^-D/D₀)ⁿ

где n - экстраполяционное число, которое определяется как значение ординаты в месте ее пересечения с экстраполированным прямолинейным участком кривой выживания. D₀ - приращение дозы, снижающее выживаемость клеток в е раз на прямолинейном участке кривой выживания. Как видно, кривые выживания имеют так называемое «плечо», т.е. относительно горизонтальный участок кривой до определенной дозы, где повышение дозы незначительно снижает количество живых клеток.

 

 

Рис. 1. Основные показатели кривой выживаемости клеток при облучении культуры клеток ELD рентгеновскими лучами (Ярмоненко и др., 1976)

 

Таким образом, построив на основе экспериментальных данных, кривую выживаемости можно определить значения величин D_37, D₀, D_q, n, которые характеризуют радиочувствительност клеток и их способность восстанавливать радиационные повреждения. При дозе D₃₇ (среднелетальной) погибает 37 % облученных клеток. D₀, D_q - характеризуют регенерационную способность клеток, которая в кончном счете характеризует устойчивость клеток к облучению. Чем выше значение D_q, чем длиннее плечо, тем выше способность клеток посрадиационному восстановлению и следовательно, их устойчивость к облучению.

Не докончнена. Доделать

 

Механизмы радиационной гибели клеток

 

Интерфазная гибель клетки при облучении обуславливается, прежде всего, нарушением структуры ее основных компонентов: ядра, органоидов и других цитоплазматических структур. Вопрос о том, какой из структурных компонентов наиболее ответственен за гибель клетки при облучении, до сих пор остается дискуссионным. Существует большое количество работ, свидетельствующих о большей радиочувствительности ядерных компонентов по сравнению с цитоплазматическими структурами. Так, летальный эффект на клетках яиц беспозвоночных достигается при локальном облучении ядер микропучками рентгеновского излучения, в интервале доз 500 - 1000 Гр. При облучении цитоплазмы аналогичный эффект наблюдался при более высоких дозах, в интервале 90 - 140 кГр. Убедительные данные о более высокой радиочувствительности ядра по сравнению с цитоплазмой, получены в экспериментах И. Орда и К. Даниели. Они установили, что пересадка летально облученных ядер в необлученную цитоплазму приводит к гибели клетки, тогда как пересадка необлученных ядер в летально облученные клетки обеспечивает почти 100 % их выживаемость. Нужно отметить и работы Б.Л. Астаурова на тутовом шелкопряде, который показал роль ядра в выживаемости облученных клеток. Раскрыть! На основании этих и других экспериментов, некоторые исследователи считают, что поражение ядра является первопричиной лучевой гибели клеток. Однако, другие эксперименты свидетельствуют, что в реализации летального эффекта при облучении клеток несомненна и роль цитоплазматических структур. Исходя из этих данных, определены основные процессы в облученной клетке, которые, в конечном счете, приводят к ее гибели.

* Структурные повреждения в молекулах нуклеиновых кислот нарушают процессы репликации, транскрипции, трансляции, т.е. реализации генетической информации.

* Нарушения в структуре белковых молекул приводят к потере активности ферментов, двигательных белков, переносчиков ионов и молекул.

* Перекисное окисление молекул липидов приводит к деструкции клеточных мембран. Это сопровождается потерей избирательной проницаемости мембран, изменением градиентов концентрации вещества, энергии в клетке и клеточных структурах. Одновременно, накопление продуктов перекисного окисления приводит к развитию токсического эффекта в клетках.

Исходя из сказанного, можно заключить, что интерфазная гибель клетки не связана с повреждением какой либо одной структуры, а происходит в результате дисперсного ее поражения. Структурные повреждения могут усиливаться за счет инициируемых радиацией физико-химических процессов. Однако, необходимо учитывать, что деструктивным процессам, вызванным облучением, в клетках противостоит система восстановления повреждений структур (репарационная система). Поэтому летальный эффект облучения в клетке, определяется соотношением двух противоположных процессов, деструктивных и репарационных.

 

Пострадиационное восстановление клеток

 

Многочисленные эксперименты показывают, что живые организмы способны восстанавливать, по крайней мере, какую-то часть лучевых повреждений. На это указывают следующие факты. Количество погибших клеток, организмов, случаев задержки клеточного деления, различные морфологические и биохимические эффекты облучения при определенной дозе уменьшаются, если эта доза поглощается дискретно, т.е. порциями с определенными промежутками времени. Перерывы между облучениями клетки используют для восстановления от ряда повреждений структур. Уменьшение интенсивности радиобиологического эффекта наблюдается и в том случае, если определенную дозу клетке или организму давать в течение длительного промежутка времени, т.е. облучение с малой мощностью дозы менее эффективно, чем облучение высоким мощностями дозы.

Восстановление после облучения - это процесс ликвидации явных или скрытых повреждений, которые могли бы привести тому или иному радиобиологическому эффекту. Различают летальные и потенциально-летальные (потенциальные) повреждения. Повреждения называют потенциальными, если они могут привести к гибели клетки, но в определенных условиях такие повреждения могут быть восстановлены репарационной системой клетки. Реализация потенциальных повреждений зависит от физиологического состояния клетки и от внешних условий. Влияние условий пострадиационного культивирования показано на различных живых объектах: вирусах, бактериальных клетках, клетках грибов, клетках растений и животных. Впервые такой факт был обнаружен еще в 1949 году Ф. Шерманом и К. Чейзом, в экспериментах с дрожжевыми клетками. Они показали, что выживаемость облученных дрожжей увеличивается, если клетки помещать в питательную среду не сразу после облучения, а после инкубации их в течение определенного времени в бу