Клеточные рецепторы тиреоидных гормонов

Хотя показано присутствие связывающих Т3 белков в цитоплазме, но они обладают относительно низким сродством по сравнению с ядерными участками, которые считаются в настоящее время ис­тинными рецепторами, ответственными за эффекты тиреоидных гормонов [112]. Так, в отличие от стероидных гормонов, тиреоидные гормоны, по-видимому, не нуждаются во взаимодействии с цитозольными рецепторами для последующей транслокации в ядро (рис. 4—29). Ядерные участки связывания Т3 обладают высоким сродством и низкой емкостью и ассоциированы с ядерными негистоновыми белками; их молекулярная масса после солюбилизации составляет примерно 50000 [111]. Они присутствуют во всех гормончувствительных тканях (печень, почки, сердце и гипофиз) и отсутствуют в тканях, не реагирующих на тиреоидные гормоны (семенники, селезенка), и, возможно, в тканях больных с семейной резистентностью к тиреоидным гормонам. Ядерное связывание мно­гочисленных аналогов Т3 тесно коррелирует с их биологической активностью, а вслед за насыщением рецепторов происходит уве­личение активности полимеразы и образования РНК.

Ядерные эффекты тиреоидных гормонов

Стимуляция ядерных процессов тиреоидными гормонами была впервые установлена Tata [114]; она включает повышенное обра­зование высокомолекулярных яРНК и мРНК, как и в случае сте­роидных гормонов. У животных с гипотиреозом скорость образова­ния как предшественника РНК, так и мРНК снижена на 40%, но она быстро восстанавливается до нормы после введения Т3. Поми­мо своих генерализованных эффектов на геном,Т3 оказывает так­же избирательное действие на мРНК, кодирующий a₂-макроглобулпн в печени и СТГ в клетках гипофиза. Вероятно, стимулирую­щее действие Т3 на активность других белков, таких, как митохон­дриальный фермент a-глицерофосфатдегидрогеназа (a-ГФД) и цитоплазматический маликфермент, также опосредуется повыше­нием синтеза специфических мРНК [ИЗ].

Общие особенности действия тиреоидных гормонов в разных тканях проявляются в разной степени как из-за видовой и ткане­вой специфичности эффектов, так и из-за индивидуальных разли­чий в зависимости между насыщенностью рецепторов и биологи­ческими реакциями. Так, влияния Т3 на a-ГФД и маликфермент заметно варьируют в разных тканях и у разных видов животных, причем каждая ткань, по-видимому, реагирует на Т3 индивидуаль­но [113]. Другой особенностью действия Т3 является его участие в мультигормональной регуляции синтеза мРНК. Это наглядно про­является на примере продукции a₂-макроглобулиновой мРНК, на которую влияют кортизол, андрогены и СТГ, равно как и Т3. Кор­тизол и Т3 оказывают также синергичное действие на синтез мРНК гормона роста в клетках гипофиза [114]. Наконец, метаболические факторы также модифицируют влияния Т3 на экспрессию отдель­ных генов, что проявляется особенно отчетливо при голодании и после введения углеводов. Так, индукция маликфермента под вли­янием Т3 зависит от приема углеводов и не происходит при голо­дании. Однако голодание не препятствует реакции a-ГФД на Т3, что опять-таки свидетельствует о значении местных клеточных факторов в проявлении эффектов тиреоидных гормонов [113]. Оче­видно, что большинство модуляций эффектов тиреоидных гормонов в отдельных тканях и в разных физиологических условиях могло бы происходить на пострецепторном уровне, реализуясь путем из­менения скорости синтеза и процессинга мРНК в ядре и их после­дующей трансляции в специфические белки в цитоплазме.

 

Глава 5. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНОВ

Ю. Л. ВАЙТУКАЙТИС (J. L. VAITUKAITIS)

ВВЕДЕНИЕ

За последние несколько лет в результате разработки более тонких, чувствительных и специфических методов определения гормонов клиническая эндокринология во многом превратилась из своего рода искусства в раздел прикладной биохимии, физиологии и фар­макологии. Этот прогресс оказался возможным благодаря выделе­нию и последующей биологической и биохимической характерис­тике различных высокоочищенных полипептидных гормонов, стероидов, витаминов, производных небольших полипептидов и аминокислот, которые относят к гормонам, а также получению меченных радиоактивными атомами гормонов с высокой удельной активностью. Многие эндокринные заболевания распознаются или по крайней мере предполагаются на основании присутствия слиш­ком большого или слишком малого количества нормально секре­тируемого гормона. Возможность определения низкого уровня гор­монов в биологических жидкостях оказала существенную помощь в упрощении диагностических исследований.

Для количественного определения гормонов в тканях и жидких средах организма вначале применялись относительно грубые и громоздкие биологические методы. С разработкой более чувстви­тельных радиоиммунологических и радиорецепторных методик появилась возможность использовать более быстрые и экономич­ные способы определения гормонов, которые по существу стали краеугольным камнем клинической эндокринологии. Несмотря на свои недостатки, классические биологические методы сохранили значение для полной характеристики гормона, особенно в услови­ях возможного расхождения его биологических и иммунологиче­ских свойств. К счастью, уровень гормонов, определяемый радио­иммунологическим и биологическим методами коррелируют друг с другом. В связи с этим концентрация гормонов, определяемая с по­мощью радиоиммунологического метода, обычно свидетельствует об уровне биологически активных гормонов в крови. Эта связь достаточно случайна, поскольку биологическая и иммунологиче­ская активность, как правило, отражает разные свойства, и прису­ща она разным участкам молекулы гормона.

Получение высокоочищенных гормональных препаратов не про­сто дало возможность разработать чувствительные методы измере­ния концентрации гормонов, но и снабдило исследователей неоце­нимым средством углубленного проникновения в механизмы их клеточного действия. С помощью этих средств выяснилось, что клинические расстройства могут обусловливаться нарушением не только секреции, но и действия гормонов в силу качественных или количественных изменений рецепторов отдельных гормонов, равно как и внутриклеточных биохимических механизмов опосредования гормонального эффекта. В настоящей главе описаны общие прин­ципы надежности методов биологического, радиоиммунологическо­го и радиорецепторного определения гормонов и общие требова­ния, предъявляемые к этим методам. В большинстве случаев ис­следования весьма сложны, требуют тонкой аппаратуры и опыта экспериментатора. Кроме того, проведение таких исследований требует времени, причем разного при определении разных гормо­нов, так что получение «моментальных» результатов редко воз­можно. Ничто не может привести заведующего лабораторией в большее уныние, чем требование определить уровень паратгормо­на в сыворотке за 10 мин после отправки пробы в лабораторию. Время, необходимое для проведения анализа, варьирует от не­скольких часов до нескольких дней в зависимости от метода опре­деления и определяемого гормона.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Результаты анализа гормонов, выполняемого в различных лабора­ториях, должны выражаться в общепринятых стандартных едини­цах. Результаты биологических исследований приводятся обычно в системе единиц международного стандарта, полу­чаемого из ВОЗ. Эти результаты могут быть выражены и в едини­цах препарата сравнения, получаемого лабораториями из центров, обслуживающих более ограниченные географические области. В таком случае результаты анализа следует сопровождать указанием на способ пересчета единиц препаратов сравнения в единицы международных стандартов. Хотя полипептидные гормо­ны и являются высокоочищенными, но в соответствующих препа­ратах присутствуют небольшие, но влияющие на результаты ана­лиза примеси; поэтому обычно избегают приводить результаты биологических и иных определений в единицах массы гормона. Количество большинства полипептидных гормонов, определяемое с помощью биологических или радиоиммунологических методов, оценивают в системе единиц, ранее установленных ВОЗ. С другой стороны, поскольку стероидные и тиреоидные гормоны существуют в химически чистом виде, результаты их определения обычно вы­ражают в единицах массы. Поскольку в разных лабораториях используют несколько (хотя и существенно) различающиеся реак­тивы и методики, каждая лаборатория должна определять пределы нормальных колебаний концентрации гормонов в пробах, отбирае­мых в стандартных условиях и анализируемых с помощью тща­тельно охарактеризованных реактивов или моделей биологического исследования.

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO

Биологические определения могут выполняться на моделях in vivo или in vitro путем оценки действия постепенно меняющихся доз препарата сравнения или стандарта и интерполяции физиологиче­ского эффекта, вызываемого гормоном, количеством которого в пробе неизвестно. Как правило, в качестве относительно специ­фичного показателя оценивают определенную реакцию, на дейст­вие гормона. Например, сравнивают реакцию массы органа-мише­ни на действие различных доз неизвестного и стандартного гормо­нального препарата. Для того чтобы результаты определения имели силу, кривые доза—реакция для препарата сравнения и не­известной пробы должны быть параллельными. Демонстративным примером служит биологическое определение активности ЛГ и ХГЧ in vivo по влиянию на массу вентральной части предстатель­ной железы. Лютеинизирующий гормон (гормон гипофиза) и ХГЧ (плацентарный гормон) обладают неотличимой биологической активностью. При этом исследовании постепенно увеличивающие­ся количества экстракта мочи вводят подкожно в дробных дозах гипофизэктомированным неполовозрелым самцам крыс на протя­жении нескольких дней и в конце этого периода определяют массу вентральной части предстательной железы. Точно так же вводят постепенно увеличивающиеся дозы препарата сравнения, обладающего известной удельной биологической активностью ЛГ или ХГЧ, и массу вентральной части предстательной железы сравни­вают с таковой у животных, получавших неизвестный препарат. Этот биологический метод адекватен для определения биологиче­ской активности как ЛГ, так и ХГЧ, поскольку оба гормона сти­мулируют синтез и секрецию тестостерона клетками Лейдига крысы, что в свою очередь через ряд биохимических этапов приводит к увеличению размеров вентральной части предстательной железы животного. Увеличение массы этого органа пропорционально коли­честву тестостерона, выделяемого семенниками, стимулированны­ми ЛГ и ХГЧ. Гипофизэктомированных животных используют для того, чтобы исключить синтез и секрецию тестостерона в ответ на эндогенный Л Г. Этот метод является одним из классических и все еще применяется для характеристики препаратов ЛГ и ХГЧ. Он был впервые предложен более 40 лет назад Greep и соавт., а впо­следствии модифицированы [1, 2].

Поскольку наклоны кривой доза-реакция от одного биологиче­ского определения к другому могут значительно варьировать даже при использовании одного и того же препарата, то каждый раз при определении необходимо производить статистический анализ на параллелизм между наклонами и однородностью отклонений кривых доза—реакция для стандарта или препарата сравнения и неизвестного препарата. В идеальном случае следует определить эффект не менее, чем в 3 достаточно отдаленных друг от друга точ­ках кривой доза—реакция с использованием проб от 3—5 животных на каждую точку для стандартного и неизвестного препарата. Только при параллелизме и гомогенности отклонений между стан­дартом и испытуемым препаратом можно сделать достоверный вывод о биологической активности и ее доверительных границах применительно к испытуемому препарату. При отсутствии такого параллелизма об активности испытуемого препарата судить нель­зя. Легко убедиться, что при биологических исследованиях любого типа не должно определяться действие в одной точке.

За многие годы предложено огромное число методов биологиче­ского тестирования in vivo. Некоторые из них достаточно грубы, нечувствительны и неспецифичны, например инсулиновые судоро­ги у мышей. Другие биологические методы значительно более спе­цифичны и чувствительны и продолжают применяться для харак­теристики очищенных гормональных препаратов.

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO

Большинство методов in vivo требует относительно больших объе­мов плазмы, мочи или тканевых экстрактов, содержащих достаточ­ное количество гормона, чтобы вызвать значимый биологический эффект. В связи с этим подобные исследования, хотя они очень важны для исходной характеристики различных гормональных препаратов, оказываются непригодными для рутинного клиниче­ского применения. За последние несколько лет разработаны раз­личные методы биологического исследования in vitro. Они не толь­ко специфичны, но и требуют значительно меньших объемов тка­невых экстрактов или биологических жидкостей, что отражает их большую чувствительность. К сожалению, такие методы требуют уровня квалификации, пока еще не доступного для большинства лабораторий, осуществляющих рутинные клинические анализы.

Как правило, критерием сравнения служат различные дозы известного гормонального препарата, по отношению к которым можно интерполировать реакцию, вызываемую неизвестной про­бой. Различные дозы или объемы неизвестной пробы исследуют в той же самой системе наблюдения, а варианты реакции как на не­известный препарат, так и на препарат сравнения или стандарт анализируют на параллелизм и гомогенность отклонений. Послед­нее требование обязательно для любых определений гормонов как in vivo, так и in vitro.

Примером биологической системы in vitro служат клетки Лей­дига, или интерстициальные клетки. Под влиянием стимуляции ЛГ пли ХГЧ клетки Лейдига синтезируют и секретируют тестостерон в количестве, зависимом от дозы стимулирующего гормона. С помо­щью известных методик [3] клетки Лейдига можно отделить от семенных канальцев. Эти клетки равномерно распределяют по пластинкам для клеточных культур и стимулируют различными концентрациями стандартных препаратов ЛГ и ХГЧ и различны­ми объемами неизвестной пробы. Тестостерон секретируется в культуральную среду, и его концентрация определяется специфи­ческим радиоиммунологическим методом.

При биологических исследованиях in vitro могут использовать­ся различные показатели; к ним относятся изменения концентра­ции стероидов, ферментов или циклических нуклеотидов. Вообще говоря, определения in vitro более чувствительны, чем соответству­ющие им определения in vivo, и требуют значительно меньших объемов экстрактов сыворотки, ткани или мочи. Однако при ин­терпретации результатов биологического исследования in vitro необходима особая осторожность, поскольку в такой системе гор­мон может быть биологически активным, a in vivo оказывать очень слабое действие. Это расхождение отражает тот факт, что гормон должен не только связываться со специфическим участком клеточ­ной поверхности и «запускать» определенную последовательность биохимических сдвигов, но и быть доставленным к соответствую­щим клеточным рецепторам в высокой концентрации, чтобы насы­тить достаточное для воспроизведения эффекта число рецепторов. В некоторых случаях в силу будто бы небольших модификаций структуры гормона его клиренс может изменяться в значительной степени.

Для того чтобы гормон вступил во взаимодействие с рецепто­ром, он должен быть биологически активным, т. е. иметь соответ­ствующую конформацию для связывания специфическим рецепто­ром с высоким сродством или прочностью связи. Однако гормон может быть биологически активным in vitro, но не обладать значи­тельной биологической активностью in vivo в силу измененного из-за своих структурных особенностей метаболического клиренса. При исследовании биологической активности десиалилированного ХГЧ in vivo и in vitro обнаруживаются существенные расхождения ее [4—7]. После лишения молекулы ХГЧ сиаловой кислоты (десиалилация) in vitro гормон оказывает такой же, если не больший, биологический эффект, что и его нативная, полностью сиалилированная молекула [6, 7]. С другой стороны, in vivo он проявляет очень небольшую биологическую активность, отражающую сте­пень десиалилации его молекулы. Это расхождение определяется значительно более коротким периодом полужизни десиалилированного ХГЧ в плазме по сравнению с интактным гормоном [5]. В свя­зи с этим десиалилированный ХГЧ in vivo достигает своих клеток-мишеней в концентрации, недостаточной для воспроизведения значительного биологического эффекта.

Методы определения одного и того же гормона в системах in vitro обычно более чувствительны, чем в системах in vivo. Неко­торые методы биологического исследования in vitro обладают даже большей чувствительностью, чем радиоиммунологические методы определения концентрации гормона. Методы биологического ис­следования in vitro, в которых в качестве показателя эффекта используются не специфическое рецепторное связывание или ак­тивация аденилатциклазы, а другие биохимические процессы, обычно в десятки, а то и сотни раз более чувствительны, чем радиоиммунологические методы. Методы биологического определения гормонов in vitro в настоящее время не входят в число рутинных способов оценки состояния больного, за исключением тех редких случаев, когда можно предположить расхождение биологической и иммунологической активности гормона.