Циркулирующие эндогенные антитела

Если в сыворотке больного присутствуют эндогенные антитела, то при определении, проводимом с помощью метода двойных анти­тел, могут быть получены завышенные результаты. Теоретически меченый гормон, добавленный в пробирку для анализа, свяжется либо с антителами больного, содержащимися в пробе сыворотки, либо с антителами, вносимыми в пробирку. Будучи получены на g-глобулин животного, у которого вырабатывали первые антитела, вторые антитела не должны осаждать гормон, связанный с g-глобулином человека, который останется в виде растворимого ком­плекса в супернатанте. В связи с этим осадок будет обладать мень­шей радиоактивностью, что отразит меньшее содержание связан­ного гормона. Поскольку концентрация гормона в пробе обратно пропорциональна количеству осажденного меченого гормона, то результат определения концентрации гормона окажется ошибочно завышенным. Все это схематически изображено на рис. 5—4. Циркулирующие антитела обычно встречаются у больных диабетом, леченных инсулином. Если у больного подозревают присутствие таких антител, то для разделения связанного с антителами и сво­бодного гормона следует применять не метод вторых антител, а какой-либо иной метод. Этого можно достичь различными путями, в том числе осаждением g-глобулином человека или сульфатом аммония. Для точного определения количества антител к данному гормону в пробе сыворотки больного существует ряд дополнитель­ных приемов.

 

 

Рис. 5—4. Схематическое изображение типичной радиоиммунологической реакции с двойными антителами (а). Наряду с добавленными в качестве известного реагента антителами в пробе присутствуют и эндогенные анти­тела к гормону (б). Эндогенные антитела искажают результаты определе­ния концентрации гормона в системе двойных антител, поскольку некото­рые комплексы гормон — антитело не осаждаются вторыми антителами, взаимодействующими с кроличьим (но не человеческим) g-глобулины.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ

Стероидные гормоны обычно содержатся в сыворотке в связанном с различными белками виде. Поскольку сывороточные белки могут обладать сродством к гормону, сходным со сродством антител, используемых в радиоиммунологическом анализе, то чтобы по­следний дал надежные результаты, гормоны нужно сначала экс­трагировать, т. е. отделить от сывороточных белков. До широкого распространения радиоиммунологических методов кортизол и дру­гие сходные стероиды, которые ассоциируются с кортизолсвязывающим глобулином (КСГ), определяли методами конкурентного белкового связывания, в которых использовали этот белок-переносчик. В настоящее время такой подход применяют реже, поскольку при этом приходится характеризовать каждую партию сыворотки, из которой извлекают КСГ, и требуется более детальное разделение стероидов с помощью тонкослойной хроматографии. Необходимость всех этих начальных этапов исследования, требующих дополни­тельного времени, а также более широкий разброс результатов от анализа к анализу отодвинул данный метод на второй план по отношению к радиоиммунологическому.

Наиболее распространенным средством разделения связанных с антителами и свободных стероидных гормонов является покрытый декстраном уголь. Он адсорбирует стероиды, не связанные с анти­телами, и переводит их в осадок. Растворимый же комплекс гор­мон—антитело остается в супернатанте. В системах определения стероидов, в которых используется гормон, меченный тритием, супернатант можно декантировать в сосуд, содержащий жидкий сцинтиллятор. В некоторых системах определения стероидных гормонов используют меченые тирозилированные стероиды. В этих случаях разделение связанного и свободного гормона проводят обычно методом двойных антител.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К МЕТОДУ

Помимо проверки чувствительности и специфичности антисыво­ротки, а также возможности проявления неспецифических эффек­тов белков плазмы или сыворотки, необходимо убедиться в надеж­ности стандартного гормона, используемого для интерполяции ко­личества гормона в биологической пробе. Сходство реакции на стандарт и клинический образец нужно оценивать путем построе­ния кривых доза—реакция для каждого из них, используя различ­ные дозы гормона или различные объемы пробы и проверяя парал­лельность этих кривых. Как отмечалось в разделе, посвященном биологическим методам, интерполяция дозы возможна только -в случае существования такой параллельности. Для контроля каче­ства гормонального стандарта нужно при каждом исследовании не только проверять наклон кривой доза—реакция, но и находить на оси абсцисс точку, которая соответствует 50% снижению исход­ного связывания. Кроме того, дополнительно следует в каждой системе радиоиммунологического определения гормона с парал­лельными пробами анализировать пулы сывороток, заведомо содер­жащих низкие, средние и высокие концентрации определяемого гормона. При радиоиммунологических исследованиях отмечается значительно меньший разброс результатов, чем при использовании биологических методов. В связи с этим в большинстве лабораторий при обычных радиоиммунологических определениях не анализиру­ют разные объемы клинических проб, если не предполагается гете­рогенность гормона.

Наконец, должна осуществляться независимая проверка надеж­ности нового метода радиоиммунологического исследования с по­мощью физиологических коррелятов и какого-либо иного, предпоч­тительнее — биологического, метода определения гормона. Вероят­но, наиболее частыми причинами изменения гормональной секре­ции являются фармакологические или пищевые воздействия, и они часто применяются для того, чтобы выяснить, будут ли ожидаемые физиологические изменения концентрации гормона «улавливать­ся» с помощью нового метода.

РАДИОРЕЦЕПТОРНЫЙ АНАЛИЗ

Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связы­ваться с антителами, связывается со специфическим гормональ­ным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специ­фические рецепторы большинства полипептидных гормонов рас­полагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина — в цитозоле и ядрах [43, 44]. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоим­мунологического и большинства биологических методов в системах in vitro. Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продол­жает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммуно­логического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что ан­титела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона.

Предложен ряд радиорецепторных методов гормонального ана­лиза. Обычно получают ткань специфического для данного гормо­на органа-мишени и с помощью стандартных методик выделяют из нее рецепторы. Изолированные рецепторы плазматической мембра­ны в осадке при хранении в условиях температуры менее —20 °С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазмати­ческих мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, ока­зываются нестабильными, что проявляется снижением их способ­ности связывать специфические гормоны, даже если они храни­лись в замороженном виде, сравнительно недолго.

Йодирование полипептидных гормонов должно осуществляться с помощью методов, изменяющих их биологическую активность лишь в минимальной степени. Для сохранения биологической активности на каждую молекулу гормона должен прихо­диться один атом йода. Чрезмерное йодированно обычно зна­чительно изменяет биологическую и иммунологическую актив­ность гормона. Кроме того, некоторые реактивы, используемые в процессе йодирования, являются сильными окислителями или восстановителями, и поэтому их концентрация должна быть сведена к минимуму. Применяющиеся в настоящее время методы йодирования описаны ранее.

 

Рис. 5—5. Скетчардовский график данных, по­лучаемых при радиоре­цепторном исследова­нии.

Обозначения см. на рис. 5-1.