Методи культивування вірусів та їх оцінка. Виявлення для репродукції вірусів в курячих ембріонах та культурі клітин. Реакція гемаглютинації, цитопатична дія вірусів, її види.

І. у цілому живому організмі (рослин, тварин) - це був перший метод. Оцінка достоїнств:1) вивчаємо взаємодію вірусів із цілим живим організмом;2) чітко бачимо результат;3) можемо вивчити розвиток хвороби - патогенез;

4) випробуємо вакцини, способи (препарати) лікування;5) накопичуємо велику кількість вірусів Недоліки:1) в організмі є свої бактерії і віруси,2) не стерильна система для одержання вакцин;3) дорогий метод;4) не універсальний метод - не можна знайти чутливих тварин

II. у 30-ті роки Бернет запропонував метод культивування в куриному ембріоні (КЕ).Оцінка достоїнств1) стандартний - використовують 9-1 2 денні КЕ;

2) стерильність;3) можемо заражати різні порожнини (жовточний мішок, ембріон, алантоісна порожнина);4) більш економічно.Недоліки:1) не всі віруси можна культивувати в КЕ;2) у КЕ можуть бути віруси лейкозу курок.

ІІІ. у культурі клітин (КК) — це сукупність клітин, отриманих із цілого живого організму, які культивуються іп Vitro (поза організмом) Оцінка достоїнств:1) вивчаємо взаємодію вірусу з клітинами,

2) можна одержувати вакцини;3) багато вірусів можна культивувати

Недоліки: 1) дуже складний і дорогий метод

Принцип одержання культури клітин:

1) із живого організму одержують шматочок тканини (печінки, нирки, пухлини, ембріона),2) шматочки роздрібнюють, а потім за допомогою трипсина розділяють до окремих клітин;3) клітини поміщають у спеціальне живильне середовище і помішають у камеру Горячева для підрахунку клітин,4) клітини в середовищі поміщають у термостат (37°С для росту).Умови для культивування клітин1) стерильність (посуд, повітря),

2) повноцінне живильне середовище - використовують дуже складні середовища, що містять білки, вуглеводи, ліпіди, амінокислоти, вітаміни, мінеральні солі. Для стерилізації в них добавляють антибіотики.

44.методи+ реакції вірусної гемаглютинації і гема адсорбції

Виявлення вірусу:ІІ. у куриному ембріоні:1) по загибелі ембріона;

2) відставання (або затримка в розвитку);3) по крововиливах і осередках некрозу на хорион алатоїсной оболонці;4) по реакції гемаглютинації (РГА) - це склеювання еритроцитів під впливом вірусів, які мають гемаглютинуючі властивості. Механізм РГА: на поверхні деяких складних вірусів є особливі рецептори - гемаглютиніни. Віруси адсорбуються на поверхню еритроцитів, завдяки гемаглютинінам вони викликають склеювання еритроцитів і утворення осаду з нерівним краєм. У нормі еритроцити осідають, характер осаду - рівний край. Оцінка достоїнств РГА: 1) РГА чітко видно в порівнянні з контролем;2) проходить швидко (1 година) у нестерильних умовах;

3) залежить від виду вірусів (віруси грипу, подагри, віспи) та від виду еритроцитів і (наприклад, вірус грипу склеює еритроцити людини і курок).

Недоліки РГА: 1) не універсальна реакція (не всі віруси мають гемаглютиніни).

Висновок: РГА пройшла, отже, ми виявили вірус, який мас гемаглютинуючі властивості. Титр вірусів у РГА 1/32 - це найбільше розведення вірусу, що викликає РГА.

ІІІ. В культурах клітин:І) по кольоровій індикаторній реакції - живі клітини змінюють рН і колір індикатора, а мертві не змінюють;2) по цитопатогенній дії вірусу (ЦПД) - спостерігаємо при малому збільшенні мікроскопа.

Види ЦПД: A) повна деструкція (руйнація) клітин — наприклад, ситеровіруси,B) часткова деструкція:a) осередкова;b) гроноподібна - аденовіруси;c) утворення симпластів або синцитіїв - це злиття уражених клітин між собою (наприклад, віруси кору, паротиту, ВІЛ, респіраторно синтиціальний вірус RS).

C) проліферації - це необмежене розмноження клітин - онкогенні (пухлинні) віруси.

3) по утворенню бляшок - це зона руйнації клітин під дією одного вірусу (умовно). Для одержання бляшок культуру покривають тонким шаром агара або бентоніта (бенгоніт — це глина, має властивості геля, її застосування для вірусних бляшок вивчив В.П.Широбоков. Гель мішає поширенню вірусів, тому утворюються окремі зони загибелі клітин - бляшки). Метод якісний і кількісний;

4) по реакції гемадсорбції — РГ адсорбції — це адсорбція еритроцитів на поверхню клітин, уражених вірусами (гемадсорбуючими).

Механізм РГ адсорбції: Складні віруси при виході з клітини змінюють її мембрану - відбувається відбруньковування. До цих змінених місць можуть прикріплюватися еритроцит (наприклад, парамексовіруси).

5) по утворенню вірусних включень — це ділянки клітини, у яких відбувається обмеження репродукції вірусів. Включення забарвлюються інакше, ніж цитоплазма (наприклад, включення Бабеша-Негрі в нейронах при сказі).

Зараження клітинних культур: 1) узяття матеріалу, що містить вірус (кров і т.ін.);

2) підготування матеріалу:a) профільтрувати через бактеріальний фільтр;

b) додати антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин.3) зараження клітинної культури:

a) вилити середовище росту;b) нанести на клітини 0,1 мл вірусу і залишити для адсорбції на 15-20 хвилин;c) внести в пробірки середовище підтримки. В дослідній пробірці був вірус, у контрольній - ні.

Зараження куриного ембріона: 1) закритий спосіб - та допомогою шприца в різні місця — у хорион аллантоїсну порожнину, у жовточний мішок, в ембріон, на хорион аллантоїсну оболонку;2) відкритий спосіб -- роблять отвір, проводять зараження, закривають склом (покривним і парафіном), спостерігають зміни.

 

45.методи+ Серологічні реакції у вірусології. PH, РГГА, РЗК... Серологічні реакції для виявлення вірусів: PH, РГГА, РЗК, кольорова проба (вірус знищує клітини і через відсутність метаболізму колір середовища залишається незмінним), РІФ. PH - антитіла імунної сироватки здатні нейтралізувати ушкоджуючу дію вірусів на чутливі клітини тканин. Відповідність вірусу використаній антисироватці виявляється придушенням бляшкоутворення (із застосуванням агарового чи бентонітового (Широбоков) покриття) у порівнянні з контролем. РГГА - заснована на здатності антитіл імунної сироватки нейтралізувати віруси, що у результаті цього процесу утрачають властивості аглютинувати еритроцити. Застосовують для діагностики грипу, кору, краснухи, кліщ енцефаліту й інших вірусів які можуть аглютинувати еритроцити різних тварин. РЗК - 1 фаза інкубації суміші шуканого антигену з діагностичною сироваткою і комплементом; 2 фаза - індикаторна - визначення вільного комплементу додаванням гемолітичної системи (еритроцити барана і гемолітична сироватка утримуюча антитіла до еритроцитів барана). При негативній реакції, якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент, залишається вільним і в 2 фазі реакції він приєднується до комплексу эритроцит - антиэритроцитарное гемолітичної сироватки, викликаючи гемоліз. Використовується для ретроспективної діагностики багатьох вірусних інфекцій на підставі виявлення специфічних антитіл у парних сироватках крові людей, а також для визначення вірусоспецифічних антигенів у різних матеріалах отриманих від хворого.

 

46. гемаглютинація +методи

по реакції гемаглютинації (РГА) - це склеювання еритроцитів під впливом вірусів, які мають гемаглютинуючі властивості. Механізм РГА: на поверхні деяких складних вірусів є особливі рецептори - гемаглютиніни. Віруси адсорбуються на поверхню еритроцитів, завдяки гемаглютинінам вони викликають склеювання еритроцитів і утворення осаду з нерівним краєм. У нормі еритроцити осідають, характер осаду - рівний край. Оцінка достоїнств РГА: 1) РГА чітко видно в порівнянні з контролем;2) проходить швидко (1 година) у нестерильних умовах;

3) залежить від виду вірусів (віруси грипу, подагри, віспи) та від виду еритроцитів і (наприклад, вірус грипу склеює еритроцити людини і курок).

Недоліки РГА: 1) не універсальна реакція (не всі віруси мають гемаглютиніни).

Висновок: РГА пройшла, отже, ми виявили вірус, який мас гемаглютинуючі властивості. Титр вірусів у РГА 1/32 - це найбільше розведення вірусу, що викликає РГА.

Методи

 

49. Використання клітинних культур у вірусології. Класифікація культур клітин. Поживні середовища для культивування клітин. Класифікація клітинних культур Враховують такі ознаки: кількість пасажей (перенос клітин у нове середовище) і походження клітин.

Типи клітинних культур:

1. Первинно трипсинізовані - одержують з швидкозростаючих ембріональних тканин (людини, мавпи), кіл-сть пасажей 8-10;

2. Пасажні або перещеплювані – одержують з пухлинних тканин, кіл-сть пасажей не обмежено. Клітини злоякісні. Не можливо вивчати взаємодію з вірусом. Але для виділення вірусів ці кліт зручні.

3. Напівперещеплювані або диплоїдні клітинні штами - одержують з норм кліток, набір хромосом диплоїдний,, кіл-сть пасажів до 100.Використ для одержання вірусних вакцин. Це клітини шкіри, легенів.

- Живильні середовища для культур кліток містять повний набір амінокислот, вітамінів, ростові фактори: гідролізат лактальбуміна, сухі середовища і концентрати, які перед використанням розводять. Для вирощування клітинних культур використовують ростові середовища, збагачені сироватками тварин і людини. (бичача сироватка, ембріональна коров'яча сироватка)

 

50. Види взаємодії вірусів і клітин. Віруси є облігатними внутрішньоклітинними паразитами. Вони проходять всі основні етапи репродукції (розмноження). За кінцевим результатом взаємодії вірусу з клітинами виділяють такі типи:

I. продуктивний тіш взаємодії - характеризується тим, що в результаті проникнення і репродукції клітина гине, з неї виходить багато вірусів (вірусне потомство);

II. інтегративний — характеризується тим, що відбувається об'єднання або інтеграція генома вірусу і клітини. Найбільш характерний такий тип для ДНК геномних вірусів (герпеса, аденовірусів), для РНК геномних інтеграція можлива за допомогою ферментів оберненої транскриптази (ОТ). ОТ - переписує інформацію з РНК вірусу, синтезує його ДНК-копію. Вона інтегрує з генома клітини. Вірус у такому стані називається провірусом (вірус імунодефіциту людини — ВІЛ).

Усі властивості вірусів як біологічних об'єктів та патогенних агентів проявляються при їхній взаємодії з чутливим клітинами. Ця взаємодія відбувається за кількома стадіями:

1. Специфічна адсорбція віруса на клітині внаслідок взаємодії білків віріона і особливих рецепторів клітини.

2. Проникнення віруса в клітину (віропексис) відбувається шляхом захоплення віріона клітиною (піноцитоз).

3. Депротеїнізація віріона - звільнення вірусного геному від білкових оболонок - "роздягання". Здійснюється при злитті оболонки віруса з мембранами клітини та при дії клітинних ферментів.

4. Синтез вірусних компонентів. Цю стадію називають "екліпс-фазою", фазою "затемнення" - в цей час вірус не виявляється як індивідуальна структура або інфекційний агент. Екліпс-фаза властива тільки вірусам.

Під час вказаної фази здійснюються процеси транскрипції - синтезу вірусних матричних молекул мРНК для ДНК-вмісних вірусів або плюс-РНК для вірусів, що мають РНК мінус-типу. З участю інформаційних молекул відбувається синтез вірусних білків на рибосомах клітини (трансляція). Одночасно йде відтворення вірусного геному - синтез віріонних ДНК або РНК (редуплікація). Залежно від типу вірусів, процеси транскрипції і редуплікації відбуваються у ядрі або цитоплазмі клітини, а трансляція - у цитоплазмі.

5. Утворення нових вірусних часток. У простих вірусів віріони утворюються шляхом самозбирання. Нуклеокапсиди складних вірусів утворюються також при самозбиранні, а суперкапсидна оболонка

формується з участю мембран клітини. Ліпіди суперкапсидної оболонки — клітинного походження, а білки - вірусного.

6. Вихід віруса з клітини. Може відбуватися одномоментно, клітина при цьому руйнується, або поступово - віріони наче "відшнуровуються" від поверхні клітини. Але через деякий час клітина також гине.

 

51-52. Поняття про патогенез вірусних інфекцій.. Патогенез – сукупність явищ процесів, що характеризують розвиток інфекції. Елементи патогенезу: 1.джерело інфекції- хворий, бактеріоносій,2. шляхи передачі або механізми (повітряно-капельний, фекально-оральний, елементарний-з їжею, контактний- статевий,укуси, трансплантаційно, трансміцитивний- через укуси кровососучих комах (комарі, блохи, кліщі), парентеральним шляхом-через інструменти), 3вхідні ворота інфекції,4. шляхи поширення, 5.органотропізм,шляхи виділення. Інфекційний процес виникає в результаті проникнення мікроорганізму в макроорганізм і його розмноження в ньому. В залежності від збудника інф процес може протікати як безсимптомне носійство (бактеріоносійство), так тяжкі форми інф процесу з летальним закінченням. Найбільш виражена форма інф процесу є інф хвороба для якої хар-ною ознакою є наявність збудника, інкубаційного періоду, специф. симптомів, імунної відповіді. Збудники інф процесу є паразити. Періоди розвитку інф. процесу: –інкубаційний (від моменту зараження до початку клінічних проявів); - продромальний період(час появи перших клінічних симптомів, не характерних для даного захворювання); -період гострих проявів захворювання(проявляються специфічні симптоми захворювання); -період реконвалесценції(період згасання і згасання типичних симптомів і до повного видужання, смерть, формування носійства).Воротами проникнення інфекції є: шкіра слизові оболонки, респіраторний,ШКТ,сечостатева система.т.д. Форми інф.процесу: 1.за тривалістю: а)гостра-інфекції швидко проходять, збудник виділяється в середовище, організм звільняється; б)хронічна – є стадія загострення і потім поліпшення, збудник довгий час знаходиться в організмі. 2.за проявами: а) клінічно виражена або маніфестна, б) безсемптомна або інапаразина; 3.за локалізацією: а) осередкова або місцева, б)генералізована; 4.за походженням а)екзогенна, б)ендогенна; 5.за кількістю збудників: а)моноінфекції, б)змішані інфекції; 6.вторинна інфекція- приєднання нових збудників; 7.суперінфекція- повторне зараження тим же видом, але при незавершеному захворюванні. При появі вторинних гнійних очаків в внутрішніх органах розвивається септимеція, а при масовому потраплянні в кров бактерій і їх токсинів може розвитись бактеріальний шок. Бактеріємія- поширення бактерій з кровю і попадання їх в органи і тканини (аналогічно:віросомія,токсинемія-стосується екзотоксина) Якщо в крові знаходиться ендотоксин-це називається токсемія. Сепсис-септикопіємія – генералізована форма інфекції, під час якої збудник потрапляє у кров. Таким чином, кількість бактерій у крові постійно підвищуєтьсся. Бактеріємія і вірусемія відрізняються від сепсису тим, що збудники не розмножуються в крові, а кров виконує транспортну функцію для мікроорганізма. Інколи після перенесеного захворювання формується реконвалесцентне носійство,коли хворий одужав але продовжує виділяти життєздатних збудників.