T – значение критерия Стьюдента (находят по таблице при известном числе степеней свободы и заданном уровне значимости Р).

 

5. µ - генеральная средняя:

µ = t.

6. t_ф – критерий для оценки достоверности различия между средними двух выборок с помощью критерия Стьюдента t:

t_ф = ,

где ( - ) – разность между средними двух

выборок; S_d – ошибка разности средних.

 

При одинаковом числе наблюдений (n₁ = n₂)

= , или

S_d = , тогда

где и – ошибка сравниваемых средних

Если вычисленное по экспериментальным данным значение t_ф будет больше, чем t табличное, то разность - является существенной; в том случае если t_ф< t – разность между средними не достоверна.

Статистическая обработка результатов исследования может быть проведена с использованием компьютерных программ, например «SPSS for Windows»

 

 

Коэффициент Стьюдента t для уровней значимости Р

Число степеней свободы (n-1)	Уровень значимости	Число степеней свободы (n-1)	Уровень значимости
0,05	0,01	0,001	0,05	0,01	0,001
	12,71	63.66	-		2,20	3,11	4,44
	4,30	9.93	31,60		2,18	3,06	4,32
	3,18	5,84	12,92		2,16	3,01	4,22
	2,78	4,60	8,61		2,15	2,98	4,14
	2,57	4,03	6,87		2,13	2,95	4,07
	2,45	3,71	5,96		2,12	2,92	4,02
	2,37	3,50	5,41		2,11	2,90	3,97
	2,31	3,36	5,04		2,10	2,88	3,92
	2,26	3,25	4,78		2,09	2,86	3,88
	2,23	3,17	4,59		2,09	2,85	3,85

ЗАНЯТИЕ III. БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ

Контрольные вопросы:

1. Приведите суммарное уравнение дыхания. В чем заключается биологическое значение дыхания?
2. Какими способами происходит биологическое окисление субстратов?
3. Опишите электрон – транспортную цепь (ЭТЦ) внутренней мембраны растительных митохондрий. Какие функции выполняет ЭТЦ дыхания? Как генерируется ∆ μ_н+ при функционировании ЭТЦ и происходит окислительное мембранное фосфорилирование?
4. Дайте характеристику NAD(P)–зависимых дегидрогеназ, флавопротеидов, цитохромов, железосерных белков, хинонов.
5. Какое значение в клеточном метаболизме имеют немитохондриальные оксидоредуктазы (полифенолоксидаза, пероксидаза, каталаза, аскорбатоксидаза, липоксигеназа и др.). В чем биологический смысл их множественности?

Дыхание – аэробное окисление органических субстратов (углеводов, липидов, белков) до оксида углерода (IV) и воды. Общее уравнение дыхания (при использовании в качестве субстрата глюкозы):

 

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ = 6 СО₂ + 6Н₂О

∆G_о′ = - 2824 кДж/моль

 

Биологическое значение дыхания многообразно.

1. В процессе дыхания происходит окисление субстрата с преобразованием энергии в конвертируемую форму АТР или протонного потенциала (энергетическая роль).

 

Дыхание протонный потенциал (∆ μ_н+) АТР

 

АТР используется для обеспечения различных энергозависимых процессов – биосинтез веществ, ионный мембранный транспорт, внутриклеточное движение.

2. Рассеяние энергии в виде тепла.

3. Дыхание как механизм образования необходимых для клеток химически активных метаболитов и удаления токсических веществ (метаболическая роль).

Окисление дыхательных субстратов осуществляется ферментными системами, обладающими высокой активностью, лабильностью и субстратной специфичностью. Конформация и, следовательно, активность белков-ферментов зависит от внешних и внутренних факторов (температуры, парциального давления кислорода, кислотности среды и др.), что обеспечивает возможность ферментной регуляции обмена веществ.

В живых системах распространены следующие 4 способа окисления:

1) отщепление двух атомов водорода:

׀ ׀

Н - С - Н Н – С + 2Н⁺ + 2ē

׀ ׀׀

Н – С – Н С - Н

׀ ׀

Алкан Алкен

 

׀ ׀

Н - С - ОН С = О + 2Н⁺ + 2ē

׀ ׀

Спирт Кетон

(или альдегид)

 

 

2) отдача электронов:

Fe⁺² Fe⁺³

3) присоединение кислорода:

2Н₂ + О₂ = 2Н₂О

4) отнятие двух атомов водорода от предварительно гидратированного соединения:

׀ ׀

Н О - С - ОН С + 2Н⁺ + 2ē

׀ / \\

Н НО О

(Альдегид в водном растворе) Кислота

Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, относятся к классу оксидоредуктазы:

ДН2     Д

Ф     ФН2

АН2     А

Донор (Д) отдает электроны и протоны, акцептор (А) принимает их, а фермент (Ф) осуществляет реакцию переноса. Выделяют несколько групп оксидоредуктаз: анаэробные дегидрогеназы, аэробные дегидрогеназы, оксидазы, оксигеназы.

1. Анаэробные дегидрогеназы не могут отдавать водород кислороду воздуха, а передают его другим акцепторам. Это двухкомпонентные ферменты, состоящие из белка и кофермента. Коферментами дегидронегаз являются никотинамидадениндинуклеотид (NAD⁺) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP⁺). NAD⁺ и NADP⁺ - зависимые дегидрогеназы обладают способностью отнимать водород непосредственно от органических соединений (органические кислоты, спирты, альдегиды, глюкоза), при этом происходит окисление субстрата и переход кофермента в восстановленную форму NADН и NADPН. NADН и NADPН могут передавать водород другому акцептору.

1. Аэробные (флавиновые) дегидрогеназы способны передавать водород, отнятый от окисляемого субстрата или от восстановленной формы анаэробной дегидрогеназы кислороду воздуха или другим соединениям. В состав простетической группы аэробных дегидрогеназ входит рибофлавин. Соединяясь со специфическим белком простетическая группа образует фермент. Примером является флавиновые ферменты, простетическая группа которых представляет собой флавинадениндинуклеотид, сокращенно FAD. Boсcтановленная форма FADН₂ может передавать водород не только кислороду воздуха, но также полифенолоксидазной или цитохромной системам. Ступенчатая ферментативная окислительно-воостановительная реакция с участием нескольких ферментов можетбыть изображена следующей схемой:

 

Субстрат   Окисленный субстрат

Анаэробная дегидрогеназа     Анаэробная дегидрогеназа× 2Н

Флавиновая дегидрогеназа× 2Н     Флавиновая дегидрогеназа

О2   Н2О2 (Н2О)

 

3. Оксидазы способны передавать водород (электроны) окисляемого субстрата только на кислород с образованием воды (пероксида водорода, супероксидного анион-радикала кислорода). Примерами оксидаз являются: цитохромоксидаза, аскорбатоксидаза, полифенолоксидаза, оксидазы аминокислот, ксантиноксидазы.

Пероксид водорода (Н₂О₂) и особенно супероксидный анион-радикал О₂¯ очень токсичны и в клетках быстро обезвреживаются специальными ферментами:

2О2¯ + 2Н^+	супероксидисмутаза	О2 + Н2О2

 

2Н2О2	каталаза	О2 + 2Н2О

Важную роль в окислительных процессах в клетке играет цитохромная система, к которой относятся железосодержащие ферменты и переносчики – цитохромы и цитохромоксидаза. Одноэлектронные переносчики с железопорфириновой простетической группой передают электроны в цепях электронного транспорта (ЦЭТ) от флавопротеидов на молекулярный кислород. Направление транспорта электронов определяется величиной редокс-потенциала цитохромов:

цит. b → цит. c ₁ → цит. c → цит. a, a₃ → О₂

К пероксидазам относят группу ферментов, использующих в качестве окислителя пероксид водорода:

АН2 + Н2О2	пероксидаза	А + 2Н2О

4. Оксигеназы – это ферменты, активирующие кислород и способствующие присоединению его к органическим молекулам. Оксигеназы участвуют в гидроксилировании аминокислот, фенолов, стеринов, а также в детоксикации вредных соединени. Монооксигеназы катализируют реакцию гидроксилирования по схеме: АН + О₂ + ДН₂ → АОН + Д + Н₂О. Диоксигеназы включают два атома кислорода в различные группировки, например:

НАН + О₂ → ОН –А – ОН; АН + О₂ → АООН

Ткани растений с интенсивным метаболизмом характеризуются и высокой активностью оксидоредуктаз.

 

Работа 1. Выявление дегидрогеназной активности тканей

 

Обнаружение дегидрогеназ основано на введении в живую растительную ткань акцептора водорода – динитробезола, восстановление которого сопровождается изменением окраски. При недостатке кислорода бесцветный о-,п-динитробензол, присоединяя водород от восстановленных дегидрогеназ, восстанавливается в тканях в желтый о-, п-нитрофенилгидроксиламин и далее в o-, п- нитроанилин также желтого цвета. О- и п-нитрофенилгидроксиламин дает в щелочной среде пурпурное окрашивание.

 

Цель работы: обнаружить дегидрогеназы в тканях клубня картофеля.

Объекты: клубни картофеля.

Реактивы и оборудование: насыщенный раствор динитробензола, 10%-ный раствор NH₄ОН в капельнице, дистиллированная вода; пробочное сверло диаметром 1 см, скальпель, штатив с пробирками, мерный цилиндр на 10 мл, термостойкие стаканы или колбы, электроплитка, термостат.

Ход работы:

1. Из клубня картофеля пробочным сверлом вырезать два одинаковых цилиндрика ткани длиной 3 см.

2. Один цилиндрик погрузить в стакан с кипящей водой на 2-3 минуты, а затем перенести для охлаждения в холодную воду.

3. Цилиндрики по одному положить в пробирки, в которые налить по 5 мл (использовать мерный цилиндр!) насыщенного раствора динитробензола. Динитробензол ядовит и поэтому после работы с ним тщательно вымыть руки!

4. Выдержать пробирки в термостате при 30-35°С в течение I часа.

5. Сравнить окраску тканей и растворов в обеих пробирках.

6. Подщелочить содержимое пробирок, добавив в каждую пробирку по 10-15 капель водного раствора аммиака.

7. Через 5-10 минут вновь сравнить окраску тканей и растворов в пробирках.

Оформление работы:

запишите наблюдения в таблицу, приведите схему ступенчатой окислительно-восстановительной реакции опыта с участием дегидрогеназ. Объясните результаты проведенного опыта.

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Дегидрогеназная активность тканей

Вариант	Окраска ткани	Окраска раствора в пробирке	Актив-ность дегидро-геназ
до опыта	после опыта	до опыта без амми-ака	после опыта
без аммиака	после добавле-ния аммиака	без амми-ака	после добавле-ния аммиака
Живая ткань
Убитая кипячением ткань

 

Работа 2. Обнаружение активности пероксидазы и полифенолоксидазы в растительной ткани

Оксидазами называются ферменты, активирующие молекулярный кислород, который соединяется с отщепляемым от субстрата водородом, образуя воду или пероксид водорода по схеме:

2АН2 + О2	оксидаза	2А + 2Н2О
АН2 + О2	оксидаза	А + Н2О2

К этой группе ферментов относится полифенолоксидаза, окисляющая полифенолы кислородом воздуха с образованием соответствующих хинонов:

		+ О2	полифенолоксидаза			+ 2Н2О

Этот фермент представляет собой белок, содержащий медь (0,2-0,3%).

Пероксидаза – фермент, катализирующий окисление полифенолов и ароматических аминов кислородом пероксида водорода или органических перекисей. Пероксидаза образует с Н₂О₂ комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода.

		+ Н2О2	пероксидаза		+ 2Н2О

Пероксидаза – двухкомпонентный фермент, простетическая группа его содержит железо, соединенное с остатком четырех пиррольных колец в виде гематина. Поскольку пероксидаза особенно легко окисляет полифенолы, она играет важную роль в дыхании растении.

Обнаружение пероксидазы и полифенолоксидазы основано на изменении окраски при окислении полифенолов в хиноны.

 

Цель работы: выявить активность полифенолоксидазы и пероксидазы в соке клубня картофеля по изменению окраски окисляемого субстрата на бурую.

Объекты: клубни картофеля.

Реактивы и оборудование: 1%-ный раствор гидрохинона, 3%-ный раствор Н₂О₂; терка, кристаллизатор, скальпель, штатив с пробирками, воронка, градуированная пипетка на 5 мл и на I мл, спиртовка, спички, держалка для пробирок, марля, фильтры бумажные.

Ход работы:

1. Натереть на терке очищенный клубень картофеля.

2.Из мезги отжать через марлю в пробирку сок, который профильтровать через бумажный фильтр в чистую пробирку.

3. В 4 пробирки внести реактивы и картофельный сок согласно схеме опыта.

I. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл Н₂О₂ + 1мл сока;

II. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл Н₂О₂;

III. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл сока;

IV. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл Н₂О₂ + 1мл сока(предварительно прокипяченного на спиртовке).

4. Отметьте окраску содержимого пробирок.

Оформление работы:

заполните таблицу, объясните результаты проведенного опыта.

 

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Обнаружение активности оксидаз – полифенолоксидазы и пероксидазы

 

Вариант	Состав смеси в пробирке	Окраска раствора в пробирке
раствор гидрохинона (субстрат)	Н2О2	картофельный сок (носитель ферментов)
I
II
III
IV

 

Работа 3. Обнаружение каталазы в листьях элодеи

Каталаза относится к классу оксидоредуктаз, под действием этого фермента происходит разложение пероксида водорода на воду и молекулярный кислород:

2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂

Каталаза – двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и простетической группы, содержащей

гематин. Роль каталазы заключается в разрушении токсичного для клеток пероксида водорода.

Обнаружение каталазы в предлагаемом опыте основано на том, что пероксид водорода, в раствор которого погружается препарат, проникает в клетки листа и расщепляется в них каталазой на воду и молекулярный кислород. Выделение пузырьков молекулярного кислорода можно наблюдать под микроскопом.

 

Цель работы: сравнить активность каталазы в разновозрастных листьях элодеи; показать влияние высокой температуры на активность фермента.

Объект: побег элодеи с верхушечной почкой.

Реактивы и оборудование: дистиллированная вода и 3%-ный раствор Н₂О₂ в капельницах; предметные и покровные стекла, препаровальные иглы, спиртовка, спички; микроскоп.

Ход работы:

1. На предметное стекло в каплю раствора Н₂О₂ положить молодой лист элодеи, закрыть покровным стеклом и сразу же начать наблюдения под микроскопом за выделением пузырьков кислорода.

2. Повторить опыт, взяв старый лист элодеи у основания побега. Сравнить скорость выделения пузырьков кислорода из старых и молодых листьев (равно активность каталазы).

1. В третьем варианте лист элодеи предварительно нагреть в капле воды на предметном стекле над пламенем спиртовки. Выделяется ли кислород в этом случае?

 

Оформление работы:

запишите результаты наблюдений в таблицу и объясните их.

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Выявление активности каталазы в растительных тканях

 

Показатель	Вариант
молодой лист элодеи	старый лист элодеи	лист после кипячения
Интенсивность выделения пузырьков кислорода
Активность каталазы