Первичная статистическая обработка данных эксперимента

Ход работы

1. На вогнутой поверхности чешуи луковицы лезвием сделать надрезы в виде небольших квадратиков (0,5 x 0,5 см). 2-3 квадратика эпидермы снять с чешуи и поместить в бюкс с раствором нейтрального красного.

2. Через 10 минут срезы из бюкса перенести в стаканчик с водой.

3. Отмытые срезы поместить в каплю раствора KNO₃ на предметном стекле, закрыть покровным стеклом и рассмотреть сначала при малом, а затем при большом увеличении микроскопа.

4. Зарисовать клетку. Обратить внимание на окраску клеточной стенки, цитоплазмы. вакуоли. Плазмолизируются ли клетки среза?

5. 2-3 среза поместить в большую каплю воды на предметном стекле и осторожно нагреть над пламенем спиртовки до появления пузырьков. После этого с убитыми кипячением клетками провести операции, описанные в пунктах 1-4.

6. Сравнить и объяснить результаты обоих опытов.

Оформление работы:

Зарисуйте (или приложите фотографии) живые и мертвые клетки после окрашивания и пребывания в растворе осмотика. Сравните и объясните результаты обоих опытов.

Результаты и обсуждение

Работа 3. Выявление живых и мертвых клеток по ферментативной активности

Соли тетразолия в окисленном состоянии бесцветны, а в восстановленном имеют окраску – красную, синюю, фиолетовую. Восстановление солей тетразолия до окрашенных формазанов происходит с участием ферментов дегидрогеназ живых клеток. В мертвых клетках дегидрогеназы неактивны, поэтому соли тетразолия не восстанавливаются и окраска не развивается.

Цель работы: определить жизнеспособность клеток растительных тканей по активности ферментов дегидрогеназ в реакции восстановления ТТХ.

Объекты: наклюнувшиеся зерновки ячменя, кукурузы, пшеницы; проростки подсолнечника, фасоли, огурцов; почки древесных растений.

Реактивы и оборудование: 0,3% раствор трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) в 0,87% растворе K₂HPO_4, дистиллированная вода; препаровальный набор, бюксы; микроскоп, термостат, спиртовка.

Ход работы

1. С выбранных объектов (зародыши наклюнувшихся семян, стеблевые апексы проростков, почки) сделать срезы. Можно использовать кончики корней длиной 2-3 мм.

2. Часть срезов положить на предметное стекло в воду и нагреть над пламенем спиртовки.

3. Живые и мертвые срезы поместить в бюксы с раствором ТТХ и выдержать в термостате при температуре 30 – 35⁰С 20 – 30 минут.

4. Сравнить окраску срезов. В каких тканях развивается наиболее яркое окрашивание? Зарисовать и объяснить наблюдаемую картину.

Оформление работы:

сравните окраску срезов обоих вариантов, объясните. Отметьте, в каких тканях жизнеспособных объектов развивается наиболее яркое окрашивание. Используйте цветные карандаши при работе с приведенными ниже схематическими рисунками проростков различных растений.

Результаты и обсуждение

Вариант 1 (живые объекты):

Фасоль пшеница горох кукуруза корень (увел.) подсолнечник

 

ЗАНЯТИЕ II. « CВОЙСТВА ЦИТОПЛАЗМЫ»

Работа 1. Микрометр окулярный винтовой (МОВ-1-15^x). Назначение, принцип действия. Измерение линейного увеличения объектива микроскопа

 

Окуляр-микрометр является принадлежность микроскопа и предназначается для измерения изображения объектов, рассматриваемых в микроскоп.

Окуляр-микрометр надевают на тубус микроскопа вместо окуляра и закрепляют винтом. В фокальной плоскости окуляра расположена подвижная шкала с делениями от 0 до 8 мм (цена деления шкалы 1 мм) и подвижные перекрестие и биштрих (рис. 1).

Рис. 1

 

При вращении микрометрического винта перекрестие и биштрих перемещаются в поле зрения относительно неподвижной шкалы. Шаг винта равен 1 мм. При повороте барабана микрометрического винта на один оборот биштрих и перекрестие в поле зрения окуляра переместятся на одно деление шкалы. Следовательно, неподвижная шкала в поле зрения окуляра служит для отсчета полных оборотов барабана винта, т.е. целых миллиметров перемещения перекрестия.

Барабан винта по окружности разделен на 100 частей, поворот барабана на одно деление соответствует перемещению перекрестия на 0,01 мм. Таким образом, шкала барабана служит для отсчета сотых долей миллиметра.

Полный отсчет по шкалам окулярного микрометра складывается из отсчета по барабану винта. Отсчет по неподвижной шкале в поле зрения определяется положением биштриха. Отсчет по барабану снимается определением соответствия деления шкалы барабана и индекса, нанесенного на неподвижном цилиндре.

Пример: Биштрих в поле зрения микроскопа расположен между делениями «3» и «4» неподвижной шкалы, а индекс приходится против деления «46» шкалы барабана. Следовательно, отсчет по шкале окуляра будет 3 мм, отсчет по барабану 0,01 х 46 = 0,46 мм. Полный отсчет равен 3 + 0,46 = 3,46 мм.

 

Оборудование: микроскоп, окуляр-микрометр, объект-микрометр.

 

Ход работы

1. Окуляр-микрометр надеть на тубус микроскопа, а объект-микрометр положить на предметный столик. Сфокусировать микроскоп на резкость изображения шкалы объект-микрометра. Работать при среднем увеличении объектива (40^Х).

Объект-микрометр – круглая стеклянная пластинка с нанесенной на неё шкалой, вмонтированная в металлическую пластинку. Шкала имеет цену деления равную 0,01 мм.

2. Для удобства измерения шкалу окуляр-микромера подвести к делению «8» неподвижной шкалы.

3. Шкалу объект-микрометра установить в поле зрения микроскопа так, чтобы первое деление шкалы находилось перед центром перекрестия, а штрихи шкалы объект-микрометра были параллельны биштриху.

4. Наблюдая в окуляр, вращением барабана микрометрического винта совместить центр перекрестия с изображением первого деления шкалы объект-микрометра. Снять отсчет по шкалам окуляр-микрометра (II).

5. Продолжая наблюдать в окуляр, вращением барабана микрометрического винта совместить центр перекрестия с изображением произвольно выбранного деления шкалы объект-микрометра на противоположном краю поля зрения. Снять второй отсчет по шкалам окуляр-микрометра (I).

6. Подсчитать число делений шкалы объект-микрометра, принятых при измерении (z).

7. Данные подставить в формулу:

β = где β – линейное увеличение объектива;

а – цена деления шкалы объект-микрометра (0,01)

 

8. Повторить измерение ещё два раза (п. 1-6). Рассчитать β_ср..

 

Результаты и обсуждение

 

Измерение, №	II	I	Z	Линейное увеличение, β
1.   2.   3.

 

 

Работа 2. Определение скорости движения цитоплазмы в клетках листа элодеи

 

Контрольные вопросы:

1. Каково биологическое значение движения цитоплазмы в растительных клетках.

2. Назовите и опишите типы движения цитоплазмы в клетках растений, приведите конкретные примеры объектов с указанным типом движения цитоплазмы.

3. Укажите факты, свидетельствующие об энергозависимости процесса движения цитоплазмы.

4. Охарактеризуйте строение микрофиламентов и микротрубочек цитоскелета. Какие функции выполняет цитоскелет клетки?

 

Движение цитоплазмы – распространенное и легко обнаруживаемое в живых клетках явление. Оно играет важную роль в переносе и распределении веществ в клетке, в реакции раздражимости. Скорость движения можно использовать для оценки уровня жизнедеятельности клетки.

Различные химические агенты, механическое воздействие, свет, температура либо ускоряют, либо замедляют и останавливают движение. Источником энергии для движения цитоплазмы, как и для большинства других физиологических процессов, служит АТФ. Движение обычно усиливается с повышением концентрации АТФ до определенного уровня, высокая концентрация АТФ ведет к повышению вязкости цитоплазмы и к замедлению или остановке движения. Различные ингибиторы и разобщители дыхания (динитрофенол – ДНФ, антибиотик олигомицин) тормозят движение цитоплазмы, что также свидетельствует об энергозависимости процесса.

Скорость движения цитоплазмы можно измерить под микроскопом по перемещению хлоропластов.

 

Цель работ:

показать, что скорость движения цитоплазмы неразрывно связана с уровнем жизнедеятельности клетки, с затратой энергии.

Реактивы и оборудование: листья элодеи, микроскоп, окуляр-микрометр, предметные и покровные стекла, фильтровальная бумага, стаканчик на 50 мл с водой, биологический термостат, секундомер, настольная лампа мощностью 100 Вт, 5·10^-3М АТФ, 5·10^-4М ДНФ в капельницах.

Ход работы:

1. Отделить лист элодеи вблизи верхушечной почки, положить на предметное стекло в каплю воды, закрыть покровным стеклом.

2. Препарат рассмотреть при малом увеличении микроскопа, выбрать наиболее легко просматриваемые участки вблизи центральной жилки. Следить за движением цитоплазмы по перемещению хлоропластов сначала при малом, а затем при среднем увеличении объектива микроскопа (15^ок.´40^об.).

3. Определить скорость движения хлоропластов, измеряя путь (ℓ, мм), который проходит органелла в единицу времени (мин), окуляр-микрометром:

а) наблюдая в окуляр и вращая барабан винта, подвести центр перекрестия к точке начала наблюдений. По шкалам микрометра сделать первый отсчет.

б) включить секундомер в момент, когда изображение перемещающегося хлоропласта совместится с центром перекрестия. Вращением винта перемещать центр перекрестия по линейному отрезку измеряемого пути так, чтобы все время перед центром перекрестия находился выбранный хлоропласт. В конце пути выключить секундомер в момент совмещения изображения хлоропласта с центром перекрестия и сделать второй отсчет.

в) зная линейное увеличение объектива микроскопа β_ср., вычислить путь, пройденный органеллой (ℓ, мм), по формуле:

ℓ (мм) = , где II - I - разность отсчетов, которая определяет величину

изображения объекта (пути).

 

г) рассчитать скорость движения хлоропласта (V) в мм/мин, зная путь, пройденный органеллой за время t' (мин).

Подсчет провести для 10 хлоропластов в 10 клетках и полученные данные статистически обработать (Справочные материалы «Первичная статистическая обработка данных эксперимента»).

Поместить каплю раствора АТФ с одной стороны покровного стекла и одновременно оттянуть полоской фильтровальной бумаги воду из-под стекла с другой стороны. Когда лист окажется в растворе АТФ, определить скорость движения цитоплазмы (см. пункт 3).

4. В следующем опыте определить скорость движения цитоплазмы, сменив воду под покровным стеклом на раствор ДНФ.

5. Веточку элодеи опустить в стакан с водой, который находился в термостате при температуре 37°С, оставить там на 20 мин. Затем приготовить препарат и определить скорость движения цитоплазмы по принятой методике.

6. Для выяснения влияния света на скорость движения цитоплазмы в клетках листа элодеи, выдержать побег элодеи в течении 15-20 минут под светом электролампы. Лампа должна быть удалена от растения на 20 - 30 см, чтобы исключить перегрев.

 

Оформление работы:

данные занесите в таблицы. Рассчитайте достоверность разницы (используя критерий Стьюдента) по показателю между контрольным и опытными вариантами. Обсудите влияние различных факторов на скорость движения цитоплазмы в клетках.

 

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Определение скорости движения цитоплазмы в клетках листа элодеи

Вариант	Пов-тор-ность	II -I	β	Время	ℓ	Скорость движения хлоропласта (V), мм/мин.
сек.	мин.

 

 

Таблица 2

Влияние внешних факторов на скорость движения цитоплазмы в клетках листа элодеи

Вариант опыта	Скорость движения хлоропластов (V), мм/мин
	S		tф	достоверность разницы
1. Вода, 20°С (контроль)
2. Вода, 37°С
3. 5·10^-3М АТФ
4. 5·10^-4М ДНФ
5. Вода, 20°С, свет

(приложение к занятию II)

ДВИЖЕНИЕ ЦИТОПЛАЗМЫ

Быстрое или почти незаметное движение цитоплазмы, которое происходит в клетках в естественных условиях, называют первичным. Движение же, индуцированное каким-либо фактором внешней среды (светом, температурой, химическим или механическим воздействием и т. п.),— вторичным. Скорость движения цитоплазмы увеличивается с повышением температуры до определенного предела последней (чаще 27—37°С). При дальнейшем увеличении температуры движение замедляется, а затем прекращается. Свет может либо ускорить движение (фотодинез), либо замедлить и остановить его. Характер реакции зависит от количества световой энергии и качественного состава света. Различные химические агенты, физические факторы также влияют на движение цитоплазмы.

Выделяют несколько типов движения цитоплазмы. Наиболее широко распространено колебательное движение. Его считают наименее упорядоченным, так как при этом одни частицы находятся в покое, другие скользят к периферии, третьи — к центру клетки. Движение имеет неустойчивый, случайный характер. Циркуляционное движение характерно для клеток, которые имеют цитоплазматические тяжи, пересекающие центральную вакуоль. Направление и скорость движения частиц, находящихся внутри или на поверхности слоя цитоплазмы, а также в цитоплазматических тяжах, непостоянны (рис. 1).

Рис. 1. Цитоплазматические потоки к клетке листового волоска Cucurbita реро (по W. Braune et al., 1971): 1 — ядро, 2 — цитоплазматические тяжи, 3 — вакуоль; направление потоков показано стрелками

При ротационном движении цитоплазма находится только на периферии клетки и движется подобно приводному ремню. Движение этого типа, в отличие от циркуляционного, имеет более или менее постоянный и упорядоченный характер, поэтому удобно для количественного изучения. Оно часто встречается в клетках листьев водных растений (элодея, валлиснерия и др.).

Помимо перечисленных выделяют еще ряд типов движения, например фонтанирующее и челночное. Типы движения разли­чаются между собой условно и в одной и той же клетке могут переходить из одного в другой.

В организации движения цитоплазмы участвуют белки, образующие цитоскелет клетки. Структуры цитоскелета подразделяют на микротрубочки и микрофиламенты. Цитоскелет — очень лабильная, постоянно меняющаяся система. Его элементы способны быстро распадаться (деполимеризоваться) и вновь собираться в структуры (полимеризоваться).

Объектом многих исследований по движению цитоплазмы являются клетки междоузлий харовых водорослей, клетки листа элодеи, волоски тычиночных нитей традесканции, клетки морских сифоновых, зеленых водорослей и ксантофитов.

Источником энергии для движения протоплазмы является АТФ. Поэтому свет может влиять на скорость этого движения, изменяя уровень АТФ, образованной в процессе фотосинтетического фосфорилирования. Различные ингибиторы и разобщители дыхания тормозят движение цитоплазмы во многих растительных клетках, что также свидетельствует об энергозависимости процесса. Так, 2, 4-динитрофенол (ДНФ) — широко применяемый разобщитель дыхания и фосфорилирования — тормозит движение цитоплазмы в концентрациях 10^-4— 10^-3 М. Его действие обратимо: после удаления реагента скорость движения восстанавливается. Олигомицин — ингибитор окислительного фосфорилирования — заметно замедляет движение цитоплазмы и снимает ускоряющее действие АТФ и АДФ. Этот антибиотик ингибирует не только процесс образования АТФ, но и активность АТФазы, очевидно, подавляя таким образом деятельность сократительных белков.

Биологическое значение движения цитоплазмы состоит в том, что оно способствует переносу веществ от одной части клетки к другой. Помимо этого, у некоторых водорослей с процессом движения связано размножение, с движением связан у грибов рост гиф. У миксомицетов, амеб, диатомовых водорослей движение цитоплазмы и передвижение организма — два неразрывных процесса. Движение цитоплазмы имеет большое значение для поглощения и выделения веществ путем зндо- и экзоцитоза. Перемещения в клетке окруженных мембраной пузырьков, образованных в результате деятельности эндоплазматической сети и аппарата Гольджи, видимо, также осуществляется с помощью движения цитоплазмы.

Различные внешние воздействия способны изменять скорость движения цитоплазмы. Ускорение движения под влиянием химических веществ называют хемодинезом. Большой интерес представляет тот факт, что хемодинез возникает при действии минимальных физиологических концентраций метаболитов растительных клеток, гормонов, некоторых аминокислот. Следовательно, скорость передвижения цитоплазмы может регулироваться продуктами метаболизма клетки.

Несмотря на то что остается много неясного в понимании физиологического значения движения цитоплазмы, несомненно, оно играет важную роль в осуществлении обмена и распределения веществ клетки, в реакциях раздражимости. Движение цитоплазмы можно охарактеризовать, определив его скорость. Однако нельзя забывать о том, что последняя зависит не только от движущей силы, но и от вязкости цитоплаз­мы. Скорость движения цитоплазмы можно измерить под мик­роскопом, наблюдая за передвижением ее частиц.

 

Справочные материалы

 

Алкан Алкен

 

׀ ׀

Н - С - ОН С = О + 2Н⁺ + 2ē

׀ ׀

Спирт Кетон

(или альдегид)

 

 

2) отдача электронов:

Fe⁺² Fe⁺³

3) присоединение кислорода:

2Н₂ + О₂ = 2Н₂О

4) отнятие двух атомов водорода от предварительно гидратированного соединения:

׀ ׀

Н О - С - ОН С + 2Н⁺ + 2ē

׀ / \\

Н НО О

(Альдегид в водном растворе) Кислота

Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, относятся к классу оксидоредуктазы:

ДН2     Д

Ф     ФН2

АН2     А

Донор (Д) отдает электроны и протоны, акцептор (А) принимает их, а фермент (Ф) осуществляет реакцию переноса. Выделяют несколько групп оксидоредуктаз: анаэробные дегидрогеназы, аэробные дегидрогеназы, оксидазы, оксигеназы.

1. Анаэробные дегидрогеназы не могут отдавать водород кислороду воздуха, а передают его другим акцепторам. Это двухкомпонентные ферменты, состоящие из белка и кофермента. Коферментами дегидронегаз являются никотинамидадениндинуклеотид (NAD⁺) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP⁺). NAD⁺ и NADP⁺ - зависимые дегидрогеназы обладают способностью отнимать водород непосредственно от органических соединений (органические кислоты, спирты, альдегиды, глюкоза), при этом происходит окисление субстрата и переход кофермента в восстановленную форму NADН и NADPН. NADН и NADPН могут передавать водород другому акцептору.

1. Аэробные (флавиновые) дегидрогеназы способны передавать водород, отнятый от окисляемого субстрата или от восстановленной формы анаэробной дегидрогеназы кислороду воздуха или другим соединениям. В состав простетической группы аэробных дегидрогеназ входит рибофлавин. Соединяясь со специфическим белком простетическая группа образует фермент. Примером является флавиновые ферменты, простетическая группа которых представляет собой флавинадениндинуклеотид, сокращенно FAD. Boсcтановленная форма FADН₂ может передавать водород не только кислороду воздуха, но также полифенолоксидазной или цитохромной системам. Ступенчатая ферментативная окислительно-воостановительная реакция с участием нескольких ферментов можетбыть изображена следующей схемой:

 

Субстрат   Окисленный субстрат

Анаэробная дегидрогеназа     Анаэробная дегидрогеназа× 2Н

Флавиновая дегидрогеназа× 2Н     Флавиновая дегидрогеназа

О2   Н2О2 (Н2О)

 

3. Оксидазы способны передавать водород (электроны) окисляемого субстрата только на кислород с образованием воды (пероксида водорода, супероксидного анион-радикала кислорода). Примерами оксидаз являются: цитохромоксидаза, аскорбатоксидаза, полифенолоксидаза, оксидазы аминокислот, ксантиноксидазы.

Пероксид водорода (Н₂О₂) и особенно супероксидный анион-радикал О₂¯ очень токсичны и в клетках быстро обезвреживаются специальными ферментами:

2О2¯ + 2Н^+	супероксидисмутаза	О2 + Н2О2

 

2Н2О2	каталаза	О2 + 2Н2О

Важную роль в окислительных процессах в клетке играет цитохромная система, к которой относятся железосодержащие ферменты и переносчики – цитохромы и цитохромоксидаза. Одноэлектронные переносчики с железопорфириновой простетической группой передают электроны в цепях электронного транспорта (ЦЭТ) от флавопротеидов на молекулярный кислород. Направление транспорта электронов определяется величиной редокс-потенциала цитохромов:

цит. b → цит. c ₁ → цит. c → цит. a, a₃ → О₂

К пероксидазам относят группу ферментов, использующих в качестве окислителя пероксид водорода:

АН2 + Н2О2	пероксидаза	А + 2Н2О

4. Оксигеназы – это ферменты, активирующие кислород и способствующие присоединению его к органическим молекулам. Оксигеназы участвуют в гидроксилировании аминокислот, фенолов, стеринов, а также в детоксикации вредных соединени. Монооксигеназы катализируют реакцию гидроксилирования по схеме: АН + О₂ + ДН₂ → АОН + Д + Н₂О. Диоксигеназы включают два атома кислорода в различные группировки, например:

НАН + О₂ → ОН –А – ОН; АН + О₂ → АООН

Ткани растений с интенсивным метаболизмом характеризуются и высокой активностью оксидоредуктаз.

 

Работа 1. Выявление дегидрогеназной активности тканей

 

Обнаружение дегидрогеназ основано на введении в живую растительную ткань акцептора водорода – динитробезола, восстановление которого сопровождается изменением окраски. При недостатке кислорода бесцветный о-,п-динитробензол, присоединяя водород от восстановленных дегидрогеназ, восстанавливается в тканях в желтый о-, п-нитрофенилгидроксиламин и далее в o-, п- нитроанилин также желтого цвета. О- и п-нитрофенилгидроксиламин дает в щелочной среде пурпурное окрашивание.

 

Цель работы: обнаружить дегидрогеназы в тканях клубня картофеля.

Объекты: клубни картофеля.

Реактивы и оборудование: насыщенный раствор динитробензола, 10%-ный раствор NH₄ОН в капельнице, дистиллированная вода; пробочное сверло диаметром 1 см, скальпель, штатив с пробирками, мерный цилиндр на 10 мл, термостойкие стаканы или колбы, электроплитка, термостат.

Ход работы:

1. Из клубня картофеля пробочным сверлом вырезать два одинаковых цилиндрика ткани длиной 3 см.

2. Один цилиндрик погрузить в стакан с кипящей водой на 2-3 минуты, а затем перенести для охлаждения в холодную воду.

3. Цилиндрики по одному положить в пробирки, в которые налить по 5 мл (использовать мерный цилиндр!) насыщенного раствора динитробензола. Динитробензол ядовит и поэтому после работы с ним тщательно вымыть руки!

4. Выдержать пробирки в термостате при 30-35°С в течение I часа.

5. Сравнить окраску тканей и растворов в обеих пробирках.

6. Подщелочить содержимое пробирок, добавив в каждую пробирку по 10-15 капель водного раствора аммиака.

7. Через 5-10 минут вновь сравнить окраску тканей и растворов в пробирках.

Оформление работы:

запишите наблюдения в таблицу, приведите схему ступенчатой окислительно-восстановительной реакции опыта с участием дегидрогеназ. Объясните результаты проведенного опыта.

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Дегидрогеназная активность тканей

Вариант	Окраска ткани	Окраска раствора в пробирке	Актив-ность дегидро-геназ
до опыта	после опыта	до опыта без амми-ака	после опыта
без аммиака	после добавле-ния аммиака	без амми-ака	после добавле-ния аммиака
Живая ткань
Убитая кипячением ткань

 

Работа 2. Обнаружение активности пероксидазы и полифенолоксидазы в растительной ткани

Оксидазами называются ферменты, активирующие молекулярный кислород, который соединяется с отщепляемым от субстрата водородом, образуя воду или пероксид водорода по схеме:

2АН2 + О2	оксидаза	2А + 2Н2О
АН2 + О2	оксидаза	А + Н2О2

К этой группе ферментов относится полифенолоксидаза, окисляющая полифенолы кислородом воздуха с образованием соответствующих хинонов:

		+ О2	полифенолоксидаза			+ 2Н2О

Этот фермент представляет собой белок, содержащий медь (0,2-0,3%).

Пероксидаза – фермент, катализирующий окисление полифенолов и ароматических аминов кислородом пероксида водорода или органических перекисей. Пероксидаза образует с Н₂О₂ комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода.

		+ Н2О2	пероксидаза		+ 2Н2О

Пероксидаза – двухкомпонентный фермент, простетическая группа его содержит железо, соединенное с остатком четырех пиррольных колец в виде гематина. Поскольку пероксидаза особенно легко окисляет полифенолы, она играет важную роль в дыхании растении.

Обнаружение пероксидазы и полифенолоксидазы основано на изменении окраски при окислении полифенолов в хиноны.

 

Цель работы: выявить активность полифенолоксидазы и пероксидазы в соке клубня картофеля по изменению окраски окисляемого субстрата на бурую.

Объекты: клубни картофеля.

Реактивы и оборудование: 1%-ный раствор гидрохинона, 3%-ный раствор Н₂О₂; терка, кристаллизатор, скальпель, штатив с пробирками, воронка, градуированная пипетка на 5 мл и на I мл, спиртовка, спички, держалка для пробирок, марля, фильтры бумажные.

Ход работы:

1. Натереть на терке очищенный клубень картофеля.

2.Из мезги отжать через марлю в пробирку сок, который профильтровать через бумажный фильтр в чистую пробирку.

3. В 4 пробирки внести реактивы и картофельный сок согласно схеме опыта.

I. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл Н₂О₂ + 1мл сока;

II. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл Н₂О₂;

III. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл сока;

IV. 5 мл раствора гидрохинона + 1 мл Н₂О₂ + 1мл сока(предварительно прокипяченного на спиртовке).

4. Отметьте окраску содержимого пробирок.

Оформление работы:

заполните таблицу, объясните результаты проведенного опыта.

 

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Обнаружение активности оксидаз – полифенолоксидазы и пероксидазы

 

Вариант	Состав смеси в пробирке	Окраска раствора в пробирке
раствор гидрохинона (субстрат)	Н2О2	картофельный сок (носитель ферментов)
I
II
III
IV

 

Работа 3. Обнаружение каталазы в листьях элодеи

Каталаза относится к классу оксидоредуктаз, под действием этого фермента происходит разложение пероксида водорода на воду и молекулярный кислород:

2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂

Каталаза – двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и простетической группы, содержащей

гематин. Роль каталазы заключается в разрушении токсичного для клеток пероксида водорода.

Обнаружение каталазы в предлагаемом опыте основано на том, что пероксид водорода, в раствор которого погружается препарат, проникает в клетки листа и расщепляется в них каталазой на воду и молекулярный кислород. Выделение пузырьков молекулярного кислорода можно наблюдать под микроскопом.

 

Цель работы: сравнить активность каталазы в разновозрастных листьях элодеи; показать влияние высокой температуры на активность фермента.

Объект: побег элодеи с верхушечной почкой.

Реактивы и оборудование: дистиллированная вода и 3%-ный раствор Н₂О₂ в капельницах; предметные и покровные стекла, препаровальные иглы, спиртовка, спички; микроскоп.

Ход работы:

1. На предметное стекло в каплю раствора Н₂О₂ положить молодой лист элодеи, закрыть покровным стеклом и сразу же начать наблюдения под микроскопом за выделением пузырьков кислорода.

2. Повторить опыт, взяв старый лист элодеи у основания побега. Сравнить скорость выделения пузырьков кислорода из старых и молодых листьев (равно активность каталазы).

1. В третьем варианте лист элодеи предварительно нагреть в капле воды на предметном стекле над пламенем спиртовки. Выделяется ли кислород в этом случае?

 

Оформление работы:

запишите результаты наблюдений в таблицу и объясните их.

Результаты и обсуждение.

Таблица 1

Выявление активности каталазы в растительных тканях

 

Показатель	Вариант
молодой лист элодеи	старый лист элодеи	лист после кипячения
Интенсивность выделения пузырьков кислорода
Активность каталазы

 

Таблица 1

Осмотический потенциал растворов сахарозы при 20° С

 

Концентрация растворов сахарозы, М	Осмотический потенциал, кПа
0,05	-130
0,10	-260
0,15	-410
0,20	-540
0,25	-680
0,30	-820
0,35	-970
0,40	-1120
0,45	-1280
0,50	-1450
0,55	-1620
0,60	-1800
0,65	-1980
0,70	-2180
0,75	-2370
0,80	-2580
0,85	-2790
0,90	-3010
0,95	-3250
1,00	-3510
1,50	-6670
2,00	-11810

Таблица 2

Приготовление растворов сахарозы заданной концентрации

 

№ пробирки	Концентрация раствора, М	Количество исходных растворов, мл
бюкса	раствора, М	1 М сахароза	диет, вода
	1,0
	0,9
	0,8
	0,7
	0,6
	0,5
	0,4
	0,3
	0,2
	0,1

 

Оптическая плотность (Д) инкубационной среды при разных температурах

 

Температура, °С
Оптическая плотность (Д)

 

 

Работа 2. Определение проницаемости клеточных мембран по выходу электролитов

Клеточные мембраны обладают избирательной