Комплексные лабораторные исследования в онкологии

Лабораторная диагностика злокачественных новообразований основана на морфологическом выявлении злокачественного процесса и изучении молекулярно-биологических изменений, характерных для опухолевого роста.
Значительные достижения теоретической и практической онкологии позволяют использовать ряд биохимических маркеров для диагностики злокачественных образований. Опухолевые маркеры либо продуцируются и секретируются клетками самой опухоли, либо высвобождаются в кровь другими клеточными структурами вследствие системного действия опухоли на организм. Маркеры представлены в основном белками в форме антигенов, ферментов, полипептидных гормонов и другими соединениями.
Для раннего выявления болезни и мониторинга ее течения, контроля за эффективностью лечения и выявления рецидивов в ранние сроки, в настоящее время широко используются иммуноферментные метода анализа, обеспечивающие высокую надежность результата.
Многолетний опыт в использовании тест-систем по выявлению онкологической патологии показывают, что подтверждение или исключение злокачественного новобразования при обследовании пациента возможен только в сочетании с другими методами диагностики. Кроме того, при диспансерном наблюдении или при проведении массовых профилактических осмотров целесообразно определять не один, а несколько опухолевых маркеров, коррелирующих между собой и позволяющих повышать точность обследования.
При установлении групп повышенного риска необходимо выявить точную локализацию уровня раковых маркеров, те провести комплексные лабораторные исследования обнаруженной опухоли.

Реакция торможения миграции лимфоцитов, принцип учета результатов.

Реакция торможения миграции лейкоцитов позволяет оценить способность Т-лимфоцитов к выработке лимфокинов в ответ на антигенную стимуляцию. Лимфокины – это биологически активные вещества (вариант цитокинов), регулирующие иммунные процессы, в том числе, тормозящие миграцию лимфоцитов из очага воспаления. Этот тест оценки функциональной активности Т-лимфоцитов может быть использован для диагностики иммунологической недостаточности (реакция с митогенами, т.е., веществами, вызывающими размножение клеток путем митоза), гиперчувствительности замедленного типа (реакция со специфическим Аg или аллергеном). Реакция торможения миграции лейкоцитов может быть также использована для выявления иммунного ответа на возбудителей инфекций, для определения степени гистосовместимости и при опухолевых процессах.

Заболевания и состояния, приводящие к изменению реакции торможения миграции лейкоцитов:

Повышение показателя	Снижение показателя
Функциональная недостаточность Т-лимфоцитов, иммунодефицит (в том числе ВИЧ-инфекция), врождённые дефекты Т-звена иммунитета, хронизация воспалительного процесса, новообразования, тяжёлые ожоги, травмы, стресс, кишечные и почечные синдромы потери белка, старение недостаточность питания, лечение цитостатиками и иммунодепрессантами Ионизирующее излучение	Снижение миграции со специфическим Аg или аллергеном свидетельствует о сенсибилизации лимфоцитов к этим Аg (аллергии) Снижение миграции с митогенами свидетельствует о гиперактивности иммунной системы при аллергических и аутоиммунных заболеваниях

Тест характеризует активность воспалительного процесса. Увеличение реакции торможения миграции лейкоцитов следует рассматривать как прогностически благоприятный фактор; клинически это сопровождается более быстрым выздоровлением больных острыми хирургическими заболеваниями после оперативного вмешательства и укорочением послеоперационного периода. Торможение миграции лейкоцитов может быть очень значительным при аллергических реакциях.

Наиболее часто применяются два митогена - конканавалин А и фитогемагглютинин (ФГА).

Перед работой необходимо подготовить капилляры. С этой целью отбирают капилляры с одинаковым внутренним диаметром.

В реакции с конканавалином А на капилляры наносят метку на расстоянии 1/3 длины от любого края. В две лунки планшета для иммунологических исследований наливают по 0.2 мл исследуемой крови. В первую порцию вносят 0.05 мл раствора Кон А в концентрации 10 мкг/мл (препарат растворяют в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия). Полученными смесями заполняют капилляры на 2 /3 длины (до метки).

В реакции с фитогемагглютинином капилляры готовят заранее: контрольные заполняют смесью Никифорова, а опытные – ФГА. Кровь набирают непосредственно из пробирки на 2/3.

Во всех модификациях РТМЛ на каждую пробу берут не менее 6 капилляров (3 опытных и 3 контрольных). Заполненные капилляры запаивают воском или пластилином и помещают в центрифугу (контрольные и опытные капилляры помещают в разные пробирки). Капилляры в пробирке необходимо зафиксировать комочком ваты или пластилином в строго вертикальном положении. После этого капилляры центрифугируют в течение 5 мин при 800 об/мин, а затем помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 часов.

После инкубации производят учет результатов (в реакции с ФГА результаты учитывают еще через 8 часов инкубации). С этой целью под микроскопом с помощью окуляр-микрометра определяют величину миграции основной массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и опыте. Результаты выражают в виде процента миграции в опыте относительно контроля.

Величины реакции торможения миграции лейкоцитов в крови в норме: миграция с фитогемагглютинином (ФГА) — 20-80%, с конканавалином А (КонА) — 40-75%, со специфическим Аg — 80-120%. Увеличение показателя миграции свидетельствует о снижении функциональной активности лимфоцитов: их способности продуцировать лимфокины, в частности, фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов (ФУМ).

 

ЦИК

Циркулирующие иммунные комплексы образуются при каждой встрече антител с антигеном и разрушаются мононуклеарными фагоцитами после активации комплемента.

При избытке вирусного антигена они образуют с антителами иммунные комплексы, которые оседают в почках или в кровеносных сосудах других органов и вызывают там воспалительные реакции, чреватые повреждением тканей (например, системные заболевания, гломерулонефрит, васкулит и др).

При длительной инфекции или при аутоиммунном заболевании персистенция антигена может приводить к болезни иммунных комплексов. При недостаточности комплемента происходит образование крупных, слабо растворимых комплексов с отложением их в тканях. Положительно заряженные антигены обладают способностью связываться с тканями, особенно с почечными клубочками, и способствовать локальному накоплению комплексов в почках. Увеличению отложения иммунных комплексов в тканях способствуют факторы, повышающие проницаемость кровеносных сосудов.

В крови комплексы не только связаны с эритроцитами, но присутствуют также в свободной форме в плазме. Связанные с эритроцитами комплексы реже оказывают повреждающее действие, поэтому больший интерес представляет определение уровня свободных ЦИК.

Для определения уровня ЦИК чаще всего применяют метод селективной преципитации полиэтиленгликолем. При данном исследовании сыворотку пациента добавляют в пробирку с полиэтиленгликолем (опыт) и боратным буфером (контроль). После инкубации при помощи спектрофотометра определяют оптическую плотность контрольного раствора и «обнуляют» показатели прибора. Затем определяют оптическую плотность опытной пробирки. Полученную величину умножают на 100, что и является величиной ЦИК, выраженной в единицах оптической плотности. Циркулирующие комплексы определяют также по их сродству к компонентам С1g и С3d комплемента, используя находящийся на твердой фазе С1g и С3d.

Снижение показателей наблюдается при нарушении синтеза белков системы комплемента.Уровень ЦИК повышен при системных заболеваниях, аутоиммунных заболеваниях, васкулитах, аллергических заболеваниях. При анализе результатов, полученных в процессе определения как ЦИК, так и иммуноглобулинов, следует учитывать, что клиническое значение имеют только кратное (в 2, 3 раза и более) повышение их содержания.

 

АСК

Стрептокиназа – это фермент гемолитического стрептококка группы А. Стрептокиназа активирует плазмин – ключевой фермент фибринолитической системы (разрушает фибриновые сгустки). Стрептокиназа - это белок с антигенными свойствами, поэтому возможна ее нейтрализация в организме соответствующими антителами. Таким образом, антистрептокиназа, активность которой мы определяем в тесте, является иммунным ферментом. В состав диагностического набора, кроме стрептокиназы, входит также тромбин, который дает в плазме образование сгустка. В присутствии стрептокиназы сгусток лизируется. Если в плазме достаточно антистрептокиназы, то она нейтрализует стрептокиназу, что проявляется наличием сгустка. Для исследования используется цитратная плазма, которую вносят в одинаковом количестве в шесть пробирок, как и тромбин. Последняя пробирка является контрольной и содержит только тромбин и плазму, и в ней всегда должен присутствовать сгусток. В остальные пробирки вносят стрептокиназу таким образом, что ее концентрация увеличивается:

Реагенты, мл	Пробирка 1	Пробирка 2	Пробирка 3	Пробирка 4	Пробирка 5	Пробирка 6 (контроль)
Цитратная плазма	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Тромбин	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Стрептокиназа	0,05	0,1	0,2	0,3	0,4	-
Активность АСК*	100	200	400	600	800	-

*Активность АСК выражают в единицах антистрептокиназы (АЕ). Уровень активности устанавливают по содержащей сгусток пробирке, предшествующей той, в которой произошел его лизис. В норме в плазме содержится до 100 АЕ, более высокий уровень свидетельствует о возможном заболевании стрептококковой природы.