Лекарственные вещества. Общие методы изолирования.

 

ЛВ (официально ЛП и наркотические средства)

1) Кислотного характера (производные барбитуровой кислоты, салициловой кислоты, некоторые снотворные).

2) Вещества нейтрального или слабокислого характера (производные п-аминофенола, СГ).

3) Вещества слабоосновного и основного характера (алкалоиды, синтетические производные ПАБК, новокаин).

Стадии изолирования:

1. Настаивание биоматериала с полярными растворителями.

Факторы, влияющие на эффективность:

а) Характер биоматериала (паренхимный орган, кости). Свежесть биоматерила. Для высокой степени и. применяют измельчение: ручное (ножницы), мельницы, гомогенизаторы, лиофильная сушка или замораживание.

б) Способ настаивания. Температура, перемешивание (режим), повышенное осмотическое давление (высаливание), применение приборов.

в) Физико-химические свойства растворителя. Общие методы – этанол 96° или вода. Разрабатываются новые методы (ацетон, ацетонитрил). Растворитель должен проникать в биоматериал, растворять ТВ и комплексы ТВ с белками (либо осаждать белки).

г) Физико-химические свойства ТВ. Гидро-/липофильность, способность образовывать комплексы с белками, прочность комплексов. Степень растворимости ТВ в растворителе.

д) рН растворителя. Создается рН=2-3, т.к. ТВ с биоматериале образует комплекс с белками за счет ионных и водородных связей, карбоксильных и аминогрупп белковых молекул. При значении рН=2-3 белок становится электронейтральным (ЧЭТ белка), связи разрушаются, ТВ высвобождается, белок остается в биоматериале или выпадает в осадок.

2. Очистка извлечения.

Очищают от пептидов, полипептидов, жиров, пигментов и т.д.

Эти вещества мешают дальнейшему исследованию.

а) Механические методы: фильтрование, процеживание, центрифугирование.

б) Физико-химические методы. Осаждение белковым молекул при температуре (40-50°С), осаждение 96° этанолом, действие высаливающих агентов (дегидратация белка понижает его растворимость), диализ, электродиализ, экстракция, реэкстракция.

3. Жидкость-жидкость экстракция. Различные неполярные (органические) растворители в зависимости от природы ТВ: хлороформ, диэтиловый эфир.

Факторы, влияющие на эффективность жидкость-жидкость экстракции:

а) Природа ТВ и растворителя. Подобное растворяется в подобном. Степень экстракции R рассчитывается по формуле:

, , где

Ро – константа распределения ТВ между органической и водной фазами.

Vв – объем водной фазы

Vo – объем органической фазы.

б) Значение рН водной фазы. Органические растворители хорошо экстрагируют недиссоциированные молекулы, поэтому при кислых значениях рН водной фазы в органический растворитель будут переходить вещества кислотного характера, а при щелочном значении рН – основного.

Оптимальные значения рН

Для веществ основного характера: рН = рКа + 2

Для веществ кислого характера: рН = рКа – 2

в) Температура. При изменении температуры может меняться растворимость в воде и органическом растворителе.

г) Наличие в водной фазе электролитов. Они повышают осмотическое давление, экстрагируемое вещество хуже растворяется.

д) Объем водной и органической фаз. Отношение объемов водной и органической фаз называется кратностью экстракции.

 

Общие методы изолирования.

Используются при нецеленаправленном исследовании биоматериал.

Метод Стаса-Отто

50,0-100,0 биоматериала измельчают и заливают абсолютным этанолом, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой до рН=2-3. Перемешиваем и проверяем значение рН, настаиваем при комнатной температуре в течение суток при периодическом перемешивании и проверяем значение рН. Жидкую фазу сливаем, операцию повторяем 2-3 раза (в течение 2-3 суток), затем биоматериал помещаем на фильтр и промываем спиртом; спиртовые вытяжки объединяют и упаривают на водяной бане при 40-50°С до густоты сиропа. Сиропообразную жидкость обрабатывают этанолом до прекращения выпадения осадка, жидкость фильтруют, снова упаривают до густоты сиропа и вновь осаждают белки. Остаток обрабатывают 20-25 мл воды, осадок отфильтровывают, проводят экстракцию хлороформа (203 порции), получают кислое хлороформное извлечение. Водную фазу подщелачивают 25% раствором NH4OH до рН=9-10, извлекают хлороформом (2-3) порции, получают щелочное хлороформное извлечение.

1. Для подкисления используют органические кислоты для избежания гидролиза сложноэфирных, амидных и других связей.

2. Для подщелачивания берут только NH4OH т.к. при использовании NaOH будут образовываться феноляты, ХР в воде.

Достоинства метода:

1. Данный метод является общим, им можно извлечь большую группу ТВ.

2. Извлечение получается чистым, можно работать с несвежим биоматериалом.

3. Этанол является универсальным растворителем и извлекает большое количество ТВ.

Недостатки:

1. Метод чрезвычайно длительный (7-10 рабочих дней).

2. Большое количество осаждений молекул приводит к потере ТВ.

3. Этанол является дорогостоящими растворителем.

 

Метод Васильевой.

50-100,0 биоматериала измельчают и заливают водой, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой и настаивают при комнатной температуре в течение 1 часа, перемешивают, проверяют значение рН, вытяжку фильтруют, центрифугируют и экстрагируют хлороформом (трижды) – осторожно, во избежание эмульгирования с водой. Водную фазу подщелачивают 20% NaOH и трижды экстрагируют хлороформом.

Достоинства:

1. Быстро (в течение 1 рабочего дня).

2. Дешево.

3. Почти отсутствуют потери ТВ из-за многократной очистки вытяжки.

Недостатки:

1. Вода является не универсальным растворителем. Извлечение содержит большое количество балластных веществ, возможно образование эмульсии на этапе экстракции. Нельзя использовать с несвежим биоматериалом.

 

Частные методы изолирования:

Применяют при целенаправленно исследовании биоматериала.

На производные барбитуровой кислоты – метод Валова.

Биоматериал измельчают (50-100,0) и заливают 80 мл воды + 20 мл 10%NaOH, настаивают 0,5 часа при периодическом перемешивании. Извлечение сливают, центрифугируют, к центрифугату добавляют 120 мл 10% раствора вольфрамата натрия и 1М H2SO4 до рН=2 (образуется вольфрамовая кислота, осаждает белки). Нагревают и кипятят 20 минут, центрифугируют, центрифугат переносят в делительную воронку и проводят извлечение эфиром. К эфирному слою добавляют 50 мл 10%NaOH, водную фазу отделяют, добавляют 25%H2SO4 до рН=2 и вновь извлекают эфиром (метод реэкстракции). Настаивание производят в щелочной воде, т.к. барбитураты образуют соли.

Достоинства:

1.Хороший выход извлечения барбитуровой кислоты.

2. Недорого, недлительно.

3. Вытяжка получается чистой

Недостатки:

1. Частный метод (для других ТВ большие потери).

 

Метод Поповой.

50-100,0 биоматериала измельчают, прибавляют 80 мл 0,01М H2SO4 до рН=2-3, перемешивают, проверяют рН, настаивают 2 часа, водную вытяжку сливают, процедуру повторяют 2 раза, водные вытяжки объединяют и центрифугируют, очищают от примесей гель-хроматографией. Колонка «Сефадекс», «Д25». Элюат – концентрируют хлороформом.

Достоинства:

1. Частный метод.

2. Чистая вытяжка.

Недостатки:

1. Дороже, т.к. необходима чистка для колонки хроматографа.

 

На алкалоид – метод Кроморенко.

50-100,0 биоматериала измельчают и заливают 0,02М раствором H2SO4 до рН=2,5 (гидролиз алкалоидов не происходит, а извлечение лучше), настаивают 2 часа при периодическом перемешивании, проверяют рН,, водный слой процеживают. Операцию проводят 2 раза. Водную вытяжку объединяют, центрифугируют, добавляют сульфат аммония до насыщения (высаливание α-белков), центрифугируют, и извлекают эфиром 2-3 раза. К водной фазе прибавляют небольшими порциями раствор NaOH 20% (водная фаза содержит (NH4)2SO4 + NaOH à NH4OH, которым и происходит подщелачивание) до рН=9-10 и экстрагируют эфиром или хлороформом.

Достоинства:

1. Частный метод ля алкалоидов, для синтетических веществ основного характера.

2. Быстро.

3. Вытяжка получается чистая.

Недостатки:

1. Для веществ кислого характере – плохо. Для некоторых групп алкалоидов – плохое извлечение.

 

Кофеин рН=4-5

Теофиллин рН=4-7

Промедол рН=7-8,5

Скополамин рН=8-10

Атропин рН=9-12

Хинин рН=10

 

На производные фенотиазина – метод Соломатина.

Биоматериал измельчают и заливают абсолютным этанолом, подкисляют щавелевой кислотой до рН=2-3 (оксалаты фенотиазина ХР в этаноле), настаивают 2 часа, вытяжку сливают, операцию повторяют 3 раза, обхединенную вытяжку упаривают на водяной бане до густоты сиропа. белки осаждаются абсолютным этанолом (смотри метод Стаса-Отто), спиртовую вытяжку упаривают досуха и растворяют в воде. Нагревают до 40-50°С, осадок отфильтровывают и проводят экстракцию эфиром 2 раза при рН=2-3. Возможно определение веществ кислого характера. Водную фазу подщелачивают до рН=13, и извлекают эфиром 2-3 раза. Эфирное извлечение обрабатывают водой, подкисляют 0,5М H2SO4, часть водной вытяжки хранят или используют для СФМ, частично вновь экстрагируют эфиром из щелочной среды и исследуют химическими методами.

(Производные фенотиазина в сухом виде быстро окисляются, поэтому их хранят в сернокислой среде).

 

Изолирование веществ из биожидкостей.

Проводят прямую жидкость-жидкость экстракцию.

К биожидкости (кровь, моча, промывные воды) с определенным значение рН (2-3 или 9-10) и затем экстрагируют органическим растворителем (хлороформ, эфир). В качестве очистки для крови используют высаливание (NH4)2SO4 или вольфраматом Na + H2SO4.

В моче – проводят реэкстракцию.

Если вещество подвергается метаболизму и в моче находится в виде глюкуронидов или сульфатов, проводят кислотный (производные 1,4-бензодиазепина) или ферментный (морфин) гидролиз. Или выполняют восстановление дитионитом натрия N-оксидов (морфин).

В качестве биожидкости может быть использована желчь.

 

Метод Груцхарди. Для бензонала, наксерона.

Производное пиримидина,

 

Бензодиазепины

Сибазон - Sibazonum

(Диазепам, Седуксен, Валиум)

 

7-хлор-5-фенил-1-метил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-он. ЛФ - табл., растворы

 

Нитразепам - Nitrazepamum

 

7-нитро-5-фенил-3Н-1,4-бенздиазпин-2-он

Соединение окрашено - за счет нитрогруппы.

 

Оксазепам - Oxazepamum

(Тазепам, Назепам)

 

7-хлор-5-фенил- 3-гидрокси -1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-он. ЛФ - табл.

 

Феназепам - Phenazepamum

 

7-бром-5-(о -хлорфенил)-3Н-1,2-дигидро-1,4-бенздиазепин-2-он.

ЛФ - табл., 0,1% р-р для инъекций.

 

В большинстве препаратов присутствует амидная связь Þ кислотные свойства.

Наличие азометиновой связи в положении 4 - 5.

Фенильный радикал - азометиновая связь

ковалентно связанный галоген или нитрогруппа в 7 положении.

 

Tox знач-е: транквилизаторы, снотворные, д/леч-я алкоголизма, пр/судорожные. Отравление: передозировка, суицид, в соч-ии с наркотиками. Стадии отр-я: 1. сонливость, слюнотеч-е, 2. ум-е сухожильных рефлексов, 3. глубокая кома, шок, 4. посткоматозное сост-е, различн осложнения. ПДП: форсированный диурез, гемодиализ, в/в ССС.

Изолирование: Стаса-Отто или Васильевой. М.б. в кислом и щелочном CHCl3 извл-ях.

Анализ: 1. по продуктам метаболизма: а) б/м настаивают с подкисленной водой или спиртом, экстрагируют CHCl3, к водному слою доб-т NH4OH до pH=9-10, снова экстр-т CHCl3. CHCl3 объед-т, выпаривают досуха, сух-й ост-к подвергают гидролизу H2SO4 или HCl. б) б/ж + HCl или H2SO4 (г-з) до бензофенонов.

Идентификация: 1. ТСХ по продуктам метаболизма (см выше) или по нативной мол-ле: детекция р-вом Драгендорфа. Система: толуол:ацетон:аммиак

1. сух остаток + 1-3 кап HClк – желтое окрашивание

2. Возможно получение азокрасителя (р-я Братона-Маршала):

Применяется как реакция подлинности. СФМ в виде области спектра (азокраситель).

К.О.: 1. после ТСХ с пластинки элюируют ацетонитрилом, испаряют, к сух-у ост-ку гептан и иссл-т м-дом ГЖХ и кач-но и кол-но. 2. ВЖХ – УФ детекция. 3. УФ спектроскопия в EtOH. 4. ФКМ по р-ии Братона-Маршала.

5. Анализ по нативной мол-ле: изол-е общее (Стас-Отто, Васильева), экстр-т CHCl3, pH=10, очистка м-м ТСХ, элюируют с пластинки и вновь наносят на пластинку со свидетелями. Обр-т HClр, в термостат, + р-р NaNO3 в HCl, удал-м изб NaNO2 cульфонатом аммония, обр-м α-нафтилэтиленамином – в местах локализации – окраш-е

 

 

Производные пурина.

Coffeinum

Theophyllinum

Theobrominum

Теофиллин и теобромин за счет незамещенного водорода при N проявляют свойства кислот – амфотерные соединения. М.б. в кислом и щелочном CHCl3 извл-ии.

1. Групповая реакция – мурексидная проба – к сух ост-ку в фарф ч доб Br2 aq, нагреваем досуха, обр-м парами аммиака – пурп-фиол-е окр-е.

Кофеин:

Р-р в CHCl3 – испаряем – кр-лы в виде %

Теофиллин:

В фарф ч-ке к сух ост-ку 30% NaOH, нагреваем, охл-м, доб 1 мл воды (р-р А). в др фарф ч стрептоцид + HCl + NaNO2 (р-р Б). р-р Б приливают к р-ру А – красное окр-е.

 

теобромин:

1. Кобальтовые соли. Препарат + 0,1M NaOH, отфильтровывают, добавляют CoCl3 (Co(NO3)3).

Теофиллин à белый с розовым оттенком

Теобромин à фиолетовый раствор à серо-голубой¯

Теофиллин в присутствии NH4OH + CoCl3 à фиолетовый раствор.

Теобромин не взаимодействует.

2. Серебряные соли. Препарат растворяют в смеси H2O и NaOH, добавляют раствор NH4OH и AgNO3. Теобромин: образуется густая, желатинообразная масса, которая разжижается при нагревании и густеет при охлаждении. Теофиллин: белый осадок.

3. ИК спектр

Теофиллин – НеГФ:

1. Азокраситель (см. выше).

2. Со щелочным раствором нитропруссида натрия à зеленое окрашивание.

 

Применение: Кофеин – стимулятор ЦНС, кардиотонический. Теофиллин и теобромин – сосудорасширяющее, бронхорасширяющее, диуретическое, спазмолитик.