Способы хранения и транспортировки спермы

1. Краткосрочное хранение спермы при плюсовых температурах

Среды – молочно-желточные смеси и синтетические среды.

ГЦЖ – глюкозо-цитарные желточные – не более 3-х суток хранение для быков, не более 1 сут для баранов.

ЛХЦЖ – лактозо-хелато-цитарная желточная среда – не более 2 суток

Разбавляют небольшими порциями, сперму быка разбавляют в 2-6 раз, хряка – до 10 раз, жеребца – 4-5, барана 2-4 раза. Затем расфасовывают в полиэтиленовые ампулы, пробирки, флаконы. Обертывают ватой или синтепоном, помещают в термос или холодильник. Сейчас такое хранение применяют редко.

Для хранения семени хряков применяют среды с хелатоном: ГХУЖ – глюкозо-хелато-цитратно-желточная или ГХУС – сульфатная. Хранят не более 3 суток, +2-5 ºС. Не должно быть колебаний температуры. Семя хряка разливают в узкогорлые стеклянные колбы на 2/3 объема, закрывают бумагой и ватно-марлевой пробкой, хранят в холодильнике, 2 раза в сутки встряхивают. Транспортировка – сперма расфасовывается в емкости, входящие в состав осеменяющего инструмента.

*Хелатон – кислота этилен-диамин-тетрауксусная

 

2. Длительное хранение спермы.

В жидком азоте -196 ºС. В гранулах (облицованных, необлицованных, или в соломинках – пайетах).

Криоконсервирование спермы быков.

а). в виде необлицованных гранул

Свежеполученную сперму (эякулят) постепенно разбавляют (2-5 мин) лактозо-глицерин-желточной средой или глюкозо-глицерин-желточной средой, соотношение 1:2 или 1:6.

Через 30 минут разбавляют основной средой (семя:среда 1 к 19 или 1:49). После 2-го разбавления помещают в холодильник +4-5 ºС на 3-4 часа, где происходит эквилибрация – глицерин проникает внутрь спермиев. Колбу оборачивают теплоизоляционным материалом. После эквилибрации проверяют активность спермиев – д.б. не менее 8 баллов.

После этого замораживают на фторпластовой пластине, не допуская нагревания. Активных сперматозоидов в дозе для замораживания д.б. не менее 37,5 млн. Обычно закладывают с концентрацией 50 млн. с активностью 8 баллов.

Замораживают сперму на пластине с лунками 0,5 cм и объемом 0,1-0,2 мл. Пластину опускают в сосуд с бурным кипением жидкого азота, затем поднимают к краю сосуда и вытирают с нее испарения стерильными салфетками. С помощью прибора или полиэтиленовых капельниц-шприцов сперму закапывают в лунки (0,15-0,2 мл). Пластину выдерживают в парах азота 1-2 мин. На расстоянии 5-10 см от поверхности жидкого азота. Сперма твердеет, затем пластину помещают в жидкий азот для лучшего отделения гранул.

Гранулы ссыпают в пенал или марлевый мешочек или стакан и помещают в сосуд Дьюара на хранение.

Повторное размораживание и замораживание не допускается, т.к. это ведет к снижению качества.

Контроль на выживаемость. Перед закладкой на хранение по 2 дозы из каждого эякулята размораживают. Оценивают активность (не ниже 4 баллов), количество патологических спермиев, концентрацию, выживаемость, помещают в термостат (38-40 ºС), периодически наблюдая активность не менее 5 часов. Все спермии должны сохранять прямолинейное поступательное движение в течение этого времени. По выживаемости судят об оплодотворяющей способности спермы.

После заморозки сперма проходит карантин не менее 20 дней, не отправляется в хозяйства.

Недостаток метода – высока доля ручного труда. Гранулы не имеют маркировки, м.б. затруднена идентификация спермы, т.к. нет покрытия гранул, происходит контакт с хладоагентом (азотом). На поверхности гранул могут адсорбироваться микроорганизмы.

Маркировка. На упаковочное единице (мешочек, стакан, пенал) обязательно указывают вид продукции, № и серия, кличка и № производителя, количество доз семени, дата заморозки, предприятие-изготовитель и его товарный знак, штамп, подпись контролера.

б). в виде облицованных гранул

Разбавленную сперму расфасовывают в полимерные трубки диаметром 3,8-4 мм. С помощью автомата ПРЖ (сварочное устройство) трубку разделяют на порции по 0,25-0,33 мм до 1 мл в каждой дозе. Проводится маркировка. Дозы помещают в тубы, пеналы, где происходит эквилибрация (4-6 часов). Затем помещают в жидкий азот. Недостаток метода – при введении спермы или разрыве гранул спермии травмируются, снижается активность.

б). в пайетах – соломинах

Разбавленную сперму под вакуумом расфасовывают в полипропиленовые трубочки, объемом 0,25 мл. Один конец запаивают, другой конец закрывают пробкой из поливинилового спирта. Маркируют, проводят эквилибрацию и замораживают – до 750 спермодоз на медном щите 5 минут. Хранят в стаканах в сосудах Дьюара.

Криоконсервирование семени хряков

Особенности – большой объем эякулята. Семя хряков хуже переживает низкие температуры, чем семя быков. При центрифугировании эякулята отделяется плазма от спермиев. Разбавляют семя средами (эякулят хряков беден питательными веществами). В течении 2 часов проводят эквилибрацию семени, замораживают по 0,2 мл.

Криоконсервирование семени баранов

Разводят средами лактозо-желточно-гуммиарабик или трис-цитратная-хелатон в 3-4 раза, эквилибрация в течении 2-9 часов, замораживают по 0,2 мл на фторпластовой пластине.

Криоконсервирование семени жеребцов

Разбавляют лактозо-хелато-цитратной смесью с желтком. Разбавляют в 4-5 раз. Расфасовывают в полипропиленовые трубки (10 мл) или алюминиевые пакеты (по 20 мл). Герметизируют тару, затем эквилибрация и расфасовка.

Транспортировка

Если семя сохраняют при +t, то транспортируют в термосах. Если замороженное семя, то в сосудах Дьюара. Во избежание взрыва стаканы (канистры) зафиксированы, пробка не должна быть герметично закрыта. Нельзя наклоняться над горловиной сосуда. При закипании может произойти выброс азота. При открытой крышке может произойти испарение азота, заправка азота в сосуд производится в очках и перчатках. Концентрация азота в воздухе свыше 16% вызывает обморок, поэтому должны работать два человека в хорошо проветриваемом помещении.

Чтобы не травмировать спермии, необходимо работать охлажденными инструментами. В сосуде постепенно накапливается О₂. При высокой температуре азот принимает газообразное состояние, что приводит к накоплению О₂. При концентрации кислорода свыше 15% - взрывоопасная смесь.1 раз в месяц проводят дозаправку сосудов. Транспортировка семени сопровождается документами: ордера на отправку семени. В них указываются кличка, № производителя, дата взятия, замораживания семени, качественные показатели (активность в баллах) и качество семени перед отправкой.

Схема сосуда Дьюара 1 — подставка 2 — вакуумированая полость 3 — теплоизоляция 4 — адсорбент 5 — наружный сосуд 6 — внутренний сосуд 7 — горловина 8 — крышка 9 — трубка для вакуумирования

Жидкий азот