Основы разбавления, хранения и транспортировки спермы

Основы разбавления, хранения и транспортировки спермы

Разбавление спермы и его значение:

1. Продление жизни спермиев во внешней среде. Для этого необходимо:

- уменьшить их активность, затормозить обменные процессы;

- обеспечить дополнительными источниками энергии;

- предотвратить накопление продуктов метаболизма;

- защитить мембрану спермиев от разрушения;

- предотвратить размножение микроорганизмов;

- повысить устойчивость спермиев к перепадам температуры;

Всё это достигается применением специальных разбавителей.

2. Увеличение объема эякулята:

- по стандарту в 1 мл спермы – 0,7 млрд. спермиев

- по ГОСТу объем эякулята должен быть не менее 3 мл, т.е. 2,1 млрд. спермиев всего.

В дозе семени должно содержаться не менее 15 млн. спермиев с прямолинейным поступательным движением (это 40% в среднем, но может быть и больше). Активность спермиев должна быть не менее 8 баллов.

Сперму быка можно разбавлять в 10-40 раз (от 1:9 до 1:39). При расчетах исходят из следующего норматива – в 1мл разбавленной спермы должно содержаться 25-50 млн. сперматозоидов (37,5 млн. в среднем):

2.1 млрд.: 50 млн. или 2,1 млрд.: 0,05 млрд. = 40 раз, во столько раз необходимо разбавить. 3 мл: 40 раз = 0,075 мл спермы идет на 1 дозу, объем увеличивают за счет добавления специальных разбавителей.

Обычно сперму быка разбавляют в 10-15 раз (1:9 или 1:14), сперму барана и жеребца -1:1, 1:3 max, хряка 1:1-1:9 max.

На 1 мл дистиллированной воды добавляется 30 г глюкозы, 4,5 г NaCl – это самая простая искусственная среда – создается оптимальный объем и оптимальное осмотическое давление. Разбавление производится не позднее 10 минут после получения спермы. С таким разбавлением сперму долго не хранят, и в течение ближайшего времени осеменяют, т.е такую среду используют для кратковременного хранения.

Для кратковременного хранения семени также можно применять естественный раствор – молоко (есть молочный сахар для питания, белки, необходимое осмотическое давление). Свежее молоко доводят до кипения и охлаждают до 25ºС. Разбавленное молоком семя хранят при температуре +2-5ºС до 7 суток. Молоко обладает буферностью, увеличивает вязкость, имеет концентрацию водородных ионов и рН сходные с маточной слизью.

 

Требования к разбавителям для длительного хранения спермы

Должны быть изотоническими для спермы данного вида животных, обладать буферными свойствами, обеспечить сперму источниками энергии, поддерживать определённое соотношение электролитов и не электролитов, защищать от холодового шока, обладать антибактериальными свойствами.

Обычно разбавители для синтетических сред имеют следующие компоненты:

- Вода, д. быть дистиллированная, служит объемным материалом

- Сахара – (глюкоза, лактоза) энергетический материал для гликолиза, дыхания. Они способствуют сохранению спермиями отрицательного заряда.

- Цитрат натрия – (лимонно-кислый натрий) обеспечивает буферность, при рН 7,8-8,0, создает нормальное осмотическое давление, нейтрализует излишнюю кислотность, также сохраняет заряд спермиев.

- Желток куриного яйца – содержит питательные вещества и биологически активные вещества, витамины, аминокислоты, холестерин, до 7% лецитина. Предохраняет от температурного шока.

- Глицерин – сохраняет спермии при заморозке, цитоплазма замерзает стеклообразно, явление витрификации (не образуются кристаллы льда, которые могут разрывать оболочку спермиев)

- Антиоксиданты (токоферол, хелатон), загустители, свободные аминокислоты (аргинин, гликол), антибиотики (стрептоцид и др.). Хелатон – двунатриевая соль этил-диамин-тетрауксусной кислоты, сохраняет спермии при комнатной температуре.

 

Разбавление спермы

В колбу отмеряют необходимое количество воды, закрываю горловину бумагой или пленкой и кипятят 1-2 мин. Охлаждают до 35ºС.

Вносят в определенной последовательности химические компоненты. После полного растворения вносят желток.

Яйца (снесенные не позднее 7 дня) моют, вытирают насухо, скорлупу стерилизуют ватным тампоном, смоченным в спирте. Разбивают по экватору, отделяют желток, который помещают на стерильный фильтр, прокалывают оболочку и фильтруют. Остатки отжимают через сложенные края фильтра. Добавляют санирующие препараты – спермосан.

 

Способы хранения и транспортировки спермы

1. Краткосрочное хранение спермы при плюсовых температурах

Среды – молочно-желточные смеси и синтетические среды.

ГЦЖ – глюкозо-цитарные желточные – не более 3-х суток хранение для быков, не более 1 сут для баранов.

ЛХЦЖ – лактозо-хелато-цитарная желточная среда – не более 2 суток

Разбавляют небольшими порциями, сперму быка разбавляют в 2-6 раз, хряка – до 10 раз, жеребца – 4-5, барана 2-4 раза. Затем расфасовывают в полиэтиленовые ампулы, пробирки, флаконы. Обертывают ватой или синтепоном, помещают в термос или холодильник. Сейчас такое хранение применяют редко.

Для хранения семени хряков применяют среды с хелатоном: ГХУЖ – глюкозо-хелато-цитратно-желточная или ГХУС – сульфатная. Хранят не более 3 суток, +2-5 ºС. Не должно быть колебаний температуры. Семя хряка разливают в узкогорлые стеклянные колбы на 2/3 объема, закрывают бумагой и ватно-марлевой пробкой, хранят в холодильнике, 2 раза в сутки встряхивают. Транспортировка – сперма расфасовывается в емкости, входящие в состав осеменяющего инструмента.

*Хелатон – кислота этилен-диамин-тетрауксусная

 

2. Длительное хранение спермы.

В жидком азоте -196 ºС. В гранулах (облицованных, необлицованных, или в соломинках – пайетах).

Криоконсервирование семени хряков

Особенности – большой объем эякулята. Семя хряков хуже переживает низкие температуры, чем семя быков. При центрифугировании эякулята отделяется плазма от спермиев. Разбавляют семя средами (эякулят хряков беден питательными веществами). В течении 2 часов проводят эквилибрацию семени, замораживают по 0,2 мл.

Криоконсервирование семени баранов

Разводят средами лактозо-желточно-гуммиарабик или трис-цитратная-хелатон в 3-4 раза, эквилибрация в течении 2-9 часов, замораживают по 0,2 мл на фторпластовой пластине.

Криоконсервирование семени жеребцов

Разбавляют лактозо-хелато-цитратной смесью с желтком. Разбавляют в 4-5 раз. Расфасовывают в полипропиленовые трубки (10 мл) или алюминиевые пакеты (по 20 мл). Герметизируют тару, затем эквилибрация и расфасовка.

Транспортировка

Если семя сохраняют при +t, то транспортируют в термосах. Если замороженное семя, то в сосудах Дьюара. Во избежание взрыва стаканы (канистры) зафиксированы, пробка не должна быть герметично закрыта. Нельзя наклоняться над горловиной сосуда. При закипании может произойти выброс азота. При открытой крышке может произойти испарение азота, заправка азота в сосуд производится в очках и перчатках. Концентрация азота в воздухе свыше 16% вызывает обморок, поэтому должны работать два человека в хорошо проветриваемом помещении.

Чтобы не травмировать спермии, необходимо работать охлажденными инструментами. В сосуде постепенно накапливается О₂. При высокой температуре азот принимает газообразное состояние, что приводит к накоплению О₂. При концентрации кислорода свыше 15% - взрывоопасная смесь.1 раз в месяц проводят дозаправку сосудов. Транспортировка семени сопровождается документами: ордера на отправку семени. В них указываются кличка, № производителя, дата взятия, замораживания семени, качественные показатели (активность в баллах) и качество семени перед отправкой.

Схема сосуда Дьюара 1 — подставка 2 — вакуумированая полость 3 — теплоизоляция 4 — адсорбент 5 — наружный сосуд 6 — внутренний сосуд 7 — горловина 8 — крышка 9 — трубка для вакуумирования

Жидкий азот

Сроки осеменения

Осеменяют клинически здоровых коров и телок. Коров – в первую охоту после отела при условии завершения инволюции (восстановления) половых органов.

Телочек осеменяют, если они достигли 75% от стандарта. Осеменяют коров и телок двукратно. Первый раз – сразу после выявления охоты, второй – через 10-12 часов при наличии охоты. Опытные специалисты осеменяют однократно ректоцервикальным методом через 10-12 часов после начала охоты. Если охота продолжается, тогда животное поверяет ветврач.

Осеменяют перед дойкой или через 2-3 часа после нее, необходимо, чтобы выработалость достаточное количество окситоцина. Через 45-60 дней после отела коров не приходящих в охоту также проверяет ветврач. После осеменения, если животное вторично не приходит в охоту через 2 месяца проводят ректальное исследование на стельность. Контроль оформляется в документах и журнале случек и отелов стада.

Техника осеменения овец

Полицикличные животные с половым сезоном (с августа по март), цикл 16-18 суток. С 2-х недельного возраста ягнята выпасаются с матками да 2-х мес. Возраста. В течение месяца после отбивки ягнят у овцематок начинают проявляться половые циклы. Осеменение овец планируется с учетом этих факторов (продолжительность суягности – 5 мес).

Осеменение проводят в течение 30-40 дней (всю отару), чтобы получить массовые охоты и ягнят одного возраста, о суягных маток содержать отдельной отарой.

Маток с низкой упитанностью и истощенных дополнительно подкармливают конц. кормами, силосом, т.к. низкая упитанность может вызвать повышение процента яловости.

Выбор маток в охоте: течка и половое возбуждение проходит в течение 2-3 суток, ≈1 сутки – охота, овуляция происходит через 1-1,5 суток после начала охоты.

За отарой закрепляют баранов-пробников из расчета 1 баран на 80-100 маток. Отару разбивают на группы по 150-200 овец. Выявляют овец в охоте 2 раза в сутки – утром и вечером. Их переводят в спец. загоны, по завершению проверки перегоняют в оцарок рядом с манежем. Спермой 1-го барана осеменяют 300-500, иногда до 6000 маток и ярок.

Сроки осеменения. К и.о. допускают маток, достигших 12-14 мес. с живой массой 75% от массы взрослых животных. Т.к. овуляция происходит в конце охоты, проводят 2-кратное осеменения. Первый раз – осеменяют сразу после выявления животных в охоте, 2-й раз – летом через сутки, зимой – через 8-10 часов (т.к. охота короче).

Осемененных животных выгоняют в отдельный загон, и с 12 по 20-й день после осеменения снова пускают к ним баранов-пробников, если матки не беременны и приходят в охоту, их снова осеменяют.

В конце случного периода, за отарой неосемененных в течение 40 дней маток закрепляют 6-8 баранов, которых разбивают на 2 группы, используемые поочередно через день. На ночь баранов удаляют из отары и содержат отдельно с подкармливанием концентратами (нагрузка на 3-4 баранов – 100 овцематок).

Техника искусственного осеменения овец. Пункты и.о. имеют дополнительные три помещения – загон для баранов, для осемененных овец и неосемененных.

Осеменяют цервикальным или влагалищным методом (визоцервикальный метод). Используют влагалищное зеркало и шприцы-полуавтоматы для введения спермы. При каждом нажатии вводится 0,05 мл.

Перед осеменением проводят туалет половых органов, затем вводят зеркало. Шприц через зеркало вводят в цервикальный канал и впрыскивают семя. Затем инструменты обрабатывают: зеркала моют и фламбируют, шприцы стерилизуют снаружи.

 

Техника осеменения свиней

Свиньи – полицикличные животные с циклом 20-22 дня, с маточным типом осеменения (коровы и овцы – с влагалищным). Эструс проявляется ч/з 2-5 суток после отъема поросят. Поросят обычно отнимают через 45 суток после опороса.

У свиней – длительная течка м период возбуждения до 9-ти суток, охота начинается через сутки после начала течки и длится 2-3 суток. Овуляция проходит через сутки-двое после начала охоты. Длится 10-48 часов, т.к. животные многоплодные.

Выбор свинок в охоте: свиноматок осеменяют только при ярко выраженной охоте. Обычно их выявляют вазэктомированным хряком (ушивают S-образный изгиб, и он не может ввести член во влагалище) или хряком с фартуком. Самок, допустивших садку хряка, осеменяют.

Сроки осеменения: в промышленных стадах свиней осеменяют в 9-10 мес. Возрасте, в племенных хозяйствах - в 10-11 мес.

Взрослых свиней осеменяют во 2-ю охоту после отъема поросят. Осеменять лучше 2 раза в охоту, но, бывает, что и чаще.

Первый раз осеменяют сразу после выявления свинки в охоте, затем – через сутки, и если охота продолжается, то через 12-15 часов осеменяют третий раз.

Техника осеменения: после выявления свинок в охоте, их переводят в манеж и расставляют по станкам, оставляют на 30 мин. Для снятия стресса. Затем проводят туалет наружных половых органов, выдерживают и проводят осеменение. Особенности осеменения: основаны на особенностях анатомического строения половых органов, не требуется визуального контроля или фиксации шейки матки. Семя вводится в матку, так называемое утеральное осеменение.

Существует 2 способа осеменения свиней.

1. Разбавленной спермой осеменяют и в качестве инструмента используют пуговчатый катетер и полиэтиленовый флакон (на 150 мл разбавленной спермы). Неразбавленной спермы требуется из расчета 1 мл (или более) на 1 кг живой массы. Сперму подогревают до 38-40°С на водяной бане, проверяют активность и идут к месту осеменения. Катетер вводят во влагалище по верхней стенке на глубину 35-40 см до упора. Затем флакон поднимают дном вверх выше уровня спины животного. Пауза, и семя самотеком вытекает благодаря всасывающим движениям матки. Проводят массаж клитора, или осеменатор может присесть на свиноматку, создавая давление на спину, имитируя хряка.

2. Фракционный метод. Отдельно вводят неразбавленную или слабо разбавленную сперму ≈ 50 мл. Затем вводят заполнитель: глюкозо-солевой раствор, чтобы протолкнуть семя в половые пути.

Свинок выдерживают после осеменения в отдельных станках до завершения охоты. Потом, через 15-20 дней, проверяют свинок повторно на проявление охоты.

Техника осеменения кобыл

Полицикличные животные. Тип осеменения – маточный. Продолжительность цикла 20-22 дня. Эструс может проявляться через 5-21 день после выжеребки, продолжительность 6-12 суток, течка слабо выражена. Охота, в среднем 6 суток, но может длится до 12-ти. Охота разделена 4 стадии: 1 – кобыла подпускает жеребца, но беспокоится; 2 – спокойно стоит при приближении жеребца, поднимает хвост при попытках садки; 3 – кобыла сама подходит к жеребцу, и происходит мочеиспускание; 4 – кобылу трудно отвести от жеребца.

В 3 и 4-ю стадии открывается канал шейки матки, при ректальном исследовании определяют флюктуацию фолликула, преддверие влагалище розово-красное, выделяется много слизи.

Особенности кобыл – нет определенной связи между овуляцией и охотой. Овуляция может наступить между 3 и 5-м днем охоты, но может произойти за 2 часа до окончания охоты.

Кобыл в охоте отбирают только жеребцом-пробником, т.к. течка выражена слабо. За кобылами наблюдают ежедневно, начиная с 5-го дня после выжеребки.

При конюшенном содержании осеменение может быть круглогодовым, или планируется на конец зимы. При табунном содержании осеменении планируют так, чтобы роды приходились на теплые месяцы (310-360 дней жеребость).

Сроки осеменения. С 3-4-летнего возраста начинают осеменять в 3-4-ю стадии охоты. Жеребцом-пробником или ректально исследуют зрелость фолликула. После первого осеменения повторно осеменяют через сутки-двое до тех пор, пока признаки охоты присутствуют, но не более 3 раз. Через 8-10 дней проверяют реакцию на жеребца-пробника. Кобыла может прийти в охоту повторно, поэтому через 30-40 дней проводят проверку на жеребость.

Техника осеменения. Способ осеменения – маточный, для осеменения используют резиновые, эбонитовые или полистироловые катетеры или стеклянные шприцы.

Осеменяют в станках, фиксируют конечности. Перед осеменением кобылу расковывают, бинтуют репицу хвоста, проводят туалет половых органов. Затем может использоваться маноутеральный метод осеменения. Катетер вводят рукой во влагалище, пальцем нащупывают устье шейки матки, а другой рукой продвигают катетер на 10-12 см через цервикальный канал. Только после этого присоединяется ампула со спермой объемом 30-40 мл, или наполненный шприц. Семя выжимается в матку.

Визоутеральный метод – вводят зеркало в половые пути, так, чтобы хорошо была видна шейка матки. Катетер вводят через зеркало в цервикальный канал (на 10-12 см), присоединяют ампулу со спермой или шприц. Семя предварительно должно быть подогрето до 30-35°С.

Основы разбавления, хранения и транспортировки спермы

Разбавление спермы и его значение:

1. Продление жизни спермиев во внешней среде. Для этого необходимо:

- уменьшить их активность, затормозить обменные процессы;

- обеспечить дополнительными источниками энергии;

- предотвратить накопление продуктов метаболизма;

- защитить мембрану спермиев от разрушения;

- предотвратить размножение микроорганизмов;

- повысить устойчивость спермиев к перепадам температуры;

Всё это достигается применением специальных разбавителей.

2. Увеличение объема эякулята:

- по стандарту в 1 мл спермы – 0,7 млрд. спермиев

- по ГОСТу объем эякулята должен быть не менее 3 мл, т.е. 2,1 млрд. спермиев всего.

В дозе семени должно содержаться не менее 15 млн. спермиев с прямолинейным поступательным движением (это 40% в среднем, но может быть и больше). Активность спермиев должна быть не менее 8 баллов.

Сперму быка можно разбавлять в 10-40 раз (от 1:9 до 1:39). При расчетах исходят из следующего норматива – в 1мл разбавленной спермы должно содержаться 25-50 млн. сперматозоидов (37,5 млн. в среднем):

2.1 млрд.: 50 млн. или 2,1 млрд.: 0,05 млрд. = 40 раз, во столько раз необходимо разбавить. 3 мл: 40 раз = 0,075 мл спермы идет на 1 дозу, объем увеличивают за счет добавления специальных разбавителей.

Обычно сперму быка разбавляют в 10-15 раз (1:9 или 1:14), сперму барана и жеребца -1:1, 1:3 max, хряка 1:1-1:9 max.

На 1 мл дистиллированной воды добавляется 30 г глюкозы, 4,5 г NaCl – это самая простая искусственная среда – создается оптимальный объем и оптимальное осмотическое давление. Разбавление производится не позднее 10 минут после получения спермы. С таким разбавлением сперму долго не хранят, и в течение ближайшего времени осеменяют, т.е такую среду используют для кратковременного хранения.

Для кратковременного хранения семени также можно применять естественный раствор – молоко (есть молочный сахар для питания, белки, необходимое осмотическое давление). Свежее молоко доводят до кипения и охлаждают до 25ºС. Разбавленное молоком семя хранят при температуре +2-5ºС до 7 суток. Молоко обладает буферностью, увеличивает вязкость, имеет концентрацию водородных ионов и рН сходные с маточной слизью.

 

Требования к разбавителям для длительного хранения спермы

Должны быть изотоническими для спермы данного вида животных, обладать буферными свойствами, обеспечить сперму источниками энергии, поддерживать определённое соотношение электролитов и не электролитов, защищать от холодового шока, обладать антибактериальными свойствами.

Обычно разбавители для синтетических сред имеют следующие компоненты:

- Вода, д. быть дистиллированная, служит объемным материалом

- Сахара – (глюкоза, лактоза) энергетический материал для гликолиза, дыхания. Они способствуют сохранению спермиями отрицательного заряда.

- Цитрат натрия – (лимонно-кислый натрий) обеспечивает буферность, при рН 7,8-8,0, создает нормальное осмотическое давление, нейтрализует излишнюю кислотность, также сохраняет заряд спермиев.

- Желток куриного яйца – содержит питательные вещества и биологически активные вещества, витамины, аминокислоты, холестерин, до 7% лецитина. Предохраняет от температурного шока.

- Глицерин – сохраняет спермии при заморозке, цитоплазма замерзает стеклообразно, явление витрификации (не образуются кристаллы льда, которые могут разрывать оболочку спермиев)

- Антиоксиданты (токоферол, хелатон), загустители, свободные аминокислоты (аргинин, гликол), антибиотики (стрептоцид и др.). Хелатон – двунатриевая соль этил-диамин-тетрауксусной кислоты, сохраняет спермии при комнатной температуре.

 

Разбавление спермы

В колбу отмеряют необходимое количество воды, закрываю горловину бумагой или пленкой и кипятят 1-2 мин. Охлаждают до 35ºС.

Вносят в определенной последовательности химические компоненты. После полного растворения вносят желток.

Яйца (снесенные не позднее 7 дня) моют, вытирают насухо, скорлупу стерилизуют ватным тампоном, смоченным в спирте. Разбивают по экватору, отделяют желток, который помещают на стерильный фильтр, прокалывают оболочку и фильтруют. Остатки отжимают через сложенные края фильтра. Добавляют санирующие препараты – спермосан.