Перед секвенированием по методу сангера молекулу днк разрезают на фрагменты и клонируют в escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью пцр.

Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырем пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.

Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определенной длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.

К достоинствам метода Сангера относятся его относительная простота и высокая точность, но, несмотря на последующие усовершенствования, он остается дорогим и трудоемким.

Регистрация сигнала

Существуют разные способы регистрации данных процессов, но обычно используется один из двух типов сигналов. Если меткой служит присоединенный к нуклеотиду флуорофор, то регистрируется испускаемый им свет определенной длины волны. Флуоресцентное детектирование применяют при секвенировании как методом удлинения цепи, так и методом лигирования.

Другой подход основан на регистрации биолюминесценции, которая инициируется связыванием с белком люциферазой пирофосфата, высвобождаемого после присоединения к праймеру очередного нуклеотида.

В обоих случаях для получения достаточно сильного сигнала приходится проводить одновременно большое число реакций комплементарного спаривания и тестировать сразу множество копий целевой последовательности.

Другие методы

Один из наиболее перспективных методов секвенирования использует для идентификации оснований в молекуле ДНК совсем другой принцип – физическое различие между четырьмя нуклеотидами, А, Т, G и С. Одноцепочечную ДНК протягивают через пору диаметром 1,5 нм, пронизывающую мембрану, и регистрируют изменение электропроводности последней по мере поочередного прохождения нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение электропроводности, что и позволяет прочитать нуклеотидную последовательность цепи.

Удлинение цепи. Одноцепочечный фрагмент ДНК, называемый матрицей, вместе с коротким олигонуклеотидом, комплементарным ее концевому участку, фиксируют на подложке (а). Добавляют флуоресцентно меченные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и полимеразу, которая присоединяет к концу праймера dNTP, комплементарный соответствующему звену матрицы (б). Несвязавшиеся dNTP и полимеразу удаляют с помощью лазера, возбуждают флуоресценцию присоединенного к праймеру нуклеотида и идентифицируют его (в). Удаляют флуорофор и продолжают удлинение цепи.

Лигирование. К одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать (а). Синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырех нуклеотидов – А, Т, G или С (б). После того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером (в). Этот момент фиксируют, идентифицируют зонд, удаляют с матрицы комплекс и повторяют всю процедуру.

Амплификация

Световой сигнал от одной молекулы, сигнализирующий о моменте присоединения к праймеру очередного нуклеотида или сшивании праймера с зондом, очень слабый. Чтобы усилить его, удлинение цепи или лигирование проводят одновременно на миллионах копий одной матрицы. Копии получают в бесклеточной системе одним из двух способов (а и б), используя в обоих случаях ПЦР.

а) Молекулярные колонии образуются прямо на стеклянной пластинке или на пластине геля. Они состоят из миллионов копий одной и той же матрицы.

б) Масляная капля с включенной в нее полимеразой служит миниатюрной реакционной камерой. Матрица, фиксированная на стеклянной бусинке, проникает внутрь капли, и на ней образуется до 10 миллионов копий

Мультиплексные системы.

Чтобы максимально ускорить процесс, секвенируют одновременно тысячи и даже миллионы разных фрагментов матрицы. Для этого их фиксируют на одной подложке и проводят реакцию удлинения цепи с регистрацией флуоресценции.

Молекулярная организация генетического аппарата биологических систем.

Нуклеиновые кислоты представляют собой линейные информационные биополимеры. Существует два основных типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК).

Так же, как РНК, ДНК состоит из длинной цепи, в которой каждое звено называется нуклеотидом. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара рибозы и фосфатной группы. Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. ДНК состоит из двух спиральных цепочек ДНК, закрученных вокруг одной оси с образованием двойной правозакрученной спирали. Гидрофильные остовы чередующихся дезоксирибозных и фосфатных групп находятся снаружи двойной спирали и по соседству с водным окружением. Водородные связи согласно принципу комплементарности соединяют аденин с тимином, гуанин с цитозином в одной плоскости. Цепи направленны антипараллельно, то есть 3'5'-фосфодиэфирные связи направлены в разные стороны. Нуклеотиды связываются водородными связями, между Ц и Г они тройные, между А и Т двойные. Образвание пар между другими основаниями дестабилизирует структуру ДНК. В двойной спирали цепочки также связаны с помощью гидрофобных взаимодействий и стэкинга, которые не зависят от последовательности оснований ДНК ДНК в зависимости условий внешней среды может принимать различные конформации(B,A,Z).

Хромосомы

Наиболее изученными являются три первых уровня упаковки: (1) накручивание ДНК на нуклеосомы с образованием нуклеосомной нити диаметром 10 нм,

Нуклеосома (nucleosome) - субъединица хроматина, состоящая из ДНК и набора из четырех пар гистоновых белков Н2А, Н2В, Н3 и Н4 одной молекулы гистона H1. Гистон Н1 связывается с линкерной ДНК между двумя нуклеосомами.

Нуклеосома является элементарной единицей упаковки хроматина. Она состоит из двойной спирали ДНК, обмотанной вокруг специфического комплекса из восьми нуклеосомных гистонов (гистонового октамера). Нуклеосома представляет собой дисковидную частицу с диаметром около 11 нм, содержащую по две копии каждого из нуклеосомных гистонов (Н2A, Н2В, НЗ, Н4). Гистоновый октамер образует белковую сердцевину, вокруг которой дважды обмотана двуспиральная ДНК (146 нуклеотидных пар ДНК на гистоновый октамер).

(2) компактизация нуклеосомной нити с образованием так называемой 30-нм фибриллы и (3) сворачивание последней в гигантские петли, закреплённые на белковой скелетной структуре ядра — ядерном матриксе.

РНК состоит из аденина (A), гуанина (G), урацила (U) и цитозина (C).

Р-РНК - рибосомальная входит в состав рибосом. Из неё построен каркас рибосом, участвует в инициации, окончании синтеза и отделения готовых молекул белка от рибосом.

И-РНК - информационная (матричная) несет генетическую информацию, транскрибируемую с ДНК о структуре полипептидной цепи в виде кодонов (триплетов нуклеотидов). Каждая из молекул иРНК по порядку расположения нуклеотидов и по размеру соответствует гену в ДНК, с которого она была транскрибирована. Каждый триплет (три нуклеотида) на иРНК называется кодоном. От кодона зависит, какая аминокислота встанет в данном месте при синтезе белка.

Т-РНК - транспортная – обеспечивает транспорт аминокислот к рибосомам. Вторичная структура у всех тРНК представлена в виде клеверного листа с двухцепочным стеблем и тремя одноцепочными). На конце одной из цепей находится акцепторный участок — триплет ЦЦА, к аденину которого присоединяется специфическая аминокислота. Роль тРНК заключается в том, что они переносят аминокислоты к рибосомам и участвуют в процессе синтеза белка. Каждая аминокислота присоединяется к определенной тРНК. Ряд аминокислот обладает более одной тРНК.

Прокариоты

Нуклеоид расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК.