Секвенирование днк по сангеру

Секвенирование ДНК по Сангеру

Перед секвенированием по методу Сангера молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью ПЦР.

Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырем пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.

Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определенной длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.

К достоинствам метода Сангера относятся его относительная простота и высокая точность, но, несмотря на последующие усовершенствования, он остается дорогим и трудоемким.

Регистрация сигнала

Существуют разные способы регистрации данных процессов, но обычно используется один из двух типов сигналов. Если меткой служит присоединенный к нуклеотиду флуорофор, то регистрируется испускаемый им свет определенной длины волны. Флуоресцентное детектирование применяют при секвенировании как методом удлинения цепи, так и методом лигирования.

Другой подход основан на регистрации биолюминесценции, которая инициируется связыванием с белком люциферазой пирофосфата, высвобождаемого после присоединения к праймеру очередного нуклеотида.

В обоих случаях для получения достаточно сильного сигнала приходится проводить одновременно большое число реакций комплементарного спаривания и тестировать сразу множество копий целевой последовательности.

Другие методы

Один из наиболее перспективных методов секвенирования использует для идентификации оснований в молекуле ДНК совсем другой принцип – физическое различие между четырьмя нуклеотидами, А, Т, G и С. Одноцепочечную ДНК протягивают через пору диаметром 1,5 нм, пронизывающую мембрану, и регистрируют изменение электропроводности последней по мере поочередного прохождения нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение электропроводности, что и позволяет прочитать нуклеотидную последовательность цепи.

Удлинение цепи. Одноцепочечный фрагмент ДНК, называемый матрицей, вместе с коротким олигонуклеотидом, комплементарным ее концевому участку, фиксируют на подложке (а). Добавляют флуоресцентно меченные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и полимеразу, которая присоединяет к концу праймера dNTP, комплементарный соответствующему звену матрицы (б). Несвязавшиеся dNTP и полимеразу удаляют с помощью лазера, возбуждают флуоресценцию присоединенного к праймеру нуклеотида и идентифицируют его (в). Удаляют флуорофор и продолжают удлинение цепи.

Лигирование. К одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать (а). Синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырех нуклеотидов – А, Т, G или С (б). После того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером (в). Этот момент фиксируют, идентифицируют зонд, удаляют с матрицы комплекс и повторяют всю процедуру.

Амплификация

Световой сигнал от одной молекулы, сигнализирующий о моменте присоединения к праймеру очередного нуклеотида или сшивании праймера с зондом, очень слабый. Чтобы усилить его, удлинение цепи или лигирование проводят одновременно на миллионах копий одной матрицы. Копии получают в бесклеточной системе одним из двух способов (а и б), используя в обоих случаях ПЦР.

а) Молекулярные колонии образуются прямо на стеклянной пластинке или на пластине геля. Они состоят из миллионов копий одной и той же матрицы.

б) Масляная капля с включенной в нее полимеразой служит миниатюрной реакционной камерой. Матрица, фиксированная на стеклянной бусинке, проникает внутрь капли, и на ней образуется до 10 миллионов копий

Мультиплексные системы.

Чтобы максимально ускорить процесс, секвенируют одновременно тысячи и даже миллионы разных фрагментов матрицы. Для этого их фиксируют на одной подложке и проводят реакцию удлинения цепи с регистрацией флуоресценции.

Молекулярная организация генетического аппарата биологических систем.

Нуклеиновые кислоты представляют собой линейные информационные биополимеры. Существует два основных типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК).

Так же, как РНК, ДНК состоит из длинной цепи, в которой каждое звено называется нуклеотидом. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара рибозы и фосфатной группы. Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. ДНК состоит из двух спиральных цепочек ДНК, закрученных вокруг одной оси с образованием двойной правозакрученной спирали. Гидрофильные остовы чередующихся дезоксирибозных и фосфатных групп находятся снаружи двойной спирали и по соседству с водным окружением. Водородные связи согласно принципу комплементарности соединяют аденин с тимином, гуанин с цитозином в одной плоскости. Цепи направленны антипараллельно, то есть 3'5'-фосфодиэфирные связи направлены в разные стороны. Нуклеотиды связываются водородными связями, между Ц и Г они тройные, между А и Т двойные. Образвание пар между другими основаниями дестабилизирует структуру ДНК. В двойной спирали цепочки также связаны с помощью гидрофобных взаимодействий и стэкинга, которые не зависят от последовательности оснований ДНК ДНК в зависимости условий внешней среды может принимать различные конформации(B,A,Z).

Хромосомы

Наиболее изученными являются три первых уровня упаковки: (1) накручивание ДНК на нуклеосомы с образованием нуклеосомной нити диаметром 10 нм,

Нуклеосома (nucleosome) - субъединица хроматина, состоящая из ДНК и набора из четырех пар гистоновых белков Н2А, Н2В, Н3 и Н4 одной молекулы гистона H1. Гистон Н1 связывается с линкерной ДНК между двумя нуклеосомами.

Нуклеосома является элементарной единицей упаковки хроматина. Она состоит из двойной спирали ДНК, обмотанной вокруг специфического комплекса из восьми нуклеосомных гистонов (гистонового октамера). Нуклеосома представляет собой дисковидную частицу с диаметром около 11 нм, содержащую по две копии каждого из нуклеосомных гистонов (Н2A, Н2В, НЗ, Н4). Гистоновый октамер образует белковую сердцевину, вокруг которой дважды обмотана двуспиральная ДНК (146 нуклеотидных пар ДНК на гистоновый октамер).

(2) компактизация нуклеосомной нити с образованием так называемой 30-нм фибриллы и (3) сворачивание последней в гигантские петли, закреплённые на белковой скелетной структуре ядра — ядерном матриксе.

РНК состоит из аденина (A), гуанина (G), урацила (U) и цитозина (C).

Р-РНК - рибосомальная входит в состав рибосом. Из неё построен каркас рибосом, участвует в инициации, окончании синтеза и отделения готовых молекул белка от рибосом.

И-РНК - информационная (матричная) несет генетическую информацию, транскрибируемую с ДНК о структуре полипептидной цепи в виде кодонов (триплетов нуклеотидов). Каждая из молекул иРНК по порядку расположения нуклеотидов и по размеру соответствует гену в ДНК, с которого она была транскрибирована. Каждый триплет (три нуклеотида) на иРНК называется кодоном. От кодона зависит, какая аминокислота встанет в данном месте при синтезе белка.

Т-РНК - транспортная – обеспечивает транспорт аминокислот к рибосомам. Вторичная структура у всех тРНК представлена в виде клеверного листа с двухцепочным стеблем и тремя одноцепочными). На конце одной из цепей находится акцепторный участок — триплет ЦЦА, к аденину которого присоединяется специфическая аминокислота. Роль тРНК заключается в том, что они переносят аминокислоты к рибосомам и участвуют в процессе синтеза белка. Каждая аминокислота присоединяется к определенной тРНК. Ряд аминокислот обладает более одной тРНК.

Прокариоты

Нуклеоид расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК.

Все, о чем мы говорили, касалось наиболее распространенной, так называемой В-формы двойной спирали ДНК. Известны также два других изомерных типа двойной спирали. Они образуются благодаря тому, что валентные углы между основаниями и сахаром могут меняться, а дезоксирибозное кольцо и сахарофосфатный остов достаточно гибки, чтобы могли сформироваться альтернативные конфигурации.

A-форма ДНК

A-форма ДНК - спиральная конформация молекулы ДНК, которую она принимает в волокнах ДНК при низкой относительной влажности или в растворах с низкой активностью растворителя. В этой форме находится в обычных условиях двойная спираль РНК, так как дополнительная гидроксильная группа сахара не дает возможность в этом случае уложить сахаро- фосфатную цепь РНК в B-спираль. Как и B-форма, эта структура является правой спиралью.

А-ДНК - единственная представительница А-семейства. В этой форме ДНК на виток спирали приходится 11 пар оснований. Период спирали в спиртовых растворах близок к этой величине. Расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали составляет 2,56 А. Пары оснований в A-ДНК, так же как и в B-ДНК, почти плоские, но в этой форме они наклонены на 20 град. относительно перпендикуляра к оси спирали и смещены относительно оси на 4,7 А, так что ось попадает в главный желобок. Это приводит к появлению полости в центре структуры; кроме того, главный желобок становится глубоким, а минорный желобок - мелким. Сахар у А-ДНК находится в С3'-эндо-конформации, а не в С2'эндо-конформации как в случае всех других модификаций ДНК. Иная, чем в B-форме, конформация сахара свидетельствует о том, что конформации A- и B- спиралей разделены энергетическим барьером. Ориентация сахара и основания относительно С1'-N- гликозидной связи также отличается: у двойных спиралей А-типа торсионный угол вращения относительно гликозидной связи лежит в области -an(-160 град).

Z-форма ДНК

Если полинуклеотид poly(dG-dC) поместить в водный раствор с высокой концентрацией MgCl2, NaCl или спирта, то образуется левая двойная спираль Z-ДНК. Повторяющейся единицей спирали является не пара нуклеотидов, а двойка соседних пар. В каждой из комплементарных нитей Z-ДНК происходит чередование син- и анти-конформаций нуклеотидных звеньев, а в каждой паре оснований одно всегда находится в син-конформации относительно гликозидной связи, другое - в анти-конформации. Схематически это изображено на Рис. Чередование конформаций оснований в Z-ДНК. У этой спирали сохраняется уотсон-криковское спаривание оснований, однако у гуанозина сахар находится в С3'-эндо-конформации, основание - в син-ориентации и угол торсионного вращения относительно связи С4'-С5' (см. Полинуклеотидная цепь) лежит в области an, тогда как для цитидина соответствующие параметры - это С2'-эндо, анти и +ск. Угол спирального вращения (т.е. угол поворота пары относительно соседней вокруг оси спирали) для Z-ДНК равен -9 или -51 градус, в зависимости от того, какой из контактов, анти-син или син-анти, реализуется в данном месте. Таким образом, на виток Z-спирали приходится 12 пар оснований.

У левых двойных спиралей есть только минорный желобок, через который проходит ось спирали: этот желобок глубокий и узкий и с двух сторон ограничен фосфатными группами. Область главного желобка заполнена атомами С5 цитидина и N7, С8 гуанина.

Содержание нуклеиновых кислот в геномах в филогенезе

По ряду соображений именно РНК, а не ДНК, могла представлять собой первичный генетический материал.

Во-первых, и в химическом синтезе, и в биохимических реакциях рибонуклеотиды предшествуют дезоксирибонуклеотидам; дезоксирибонуклеотиды - продукты модификации рибонуклеотидов.

Во-вторых, в самых древних, универсальных процессах жизненного метаболизма широко представлены именно рибонуклеотиды, а не дезоксирибонуклеотиды, включая основные энергетические носители типа рибонуклеозид-полифосфатов (АТФ и т.п.).

В-третьих, репликация РНК может происходить без какого бы то ни было участия ДНК, а механизм редупликации ДНК даже в современном живом мире требует обязательного участия РНК-затравки в инициации синтеза цепи ДНК.

В-четвертых, обладая всеми теми же матричными и генетическими функциями, что и ДНК, РНК способна также к выполнению ряда функций, присущих белкам, включая катализ химических реакций.

Таким образом, имеются все основания рассматривать ДНК как более позднее эволюционное приобретение - как модификацию РНК, специализированную для выполнения функции воспроизведения и хранения уникальных копий генов в составе клеточного генома без непосредственного участия в биосинтезе белков.

После того как были открыты каталитически активные РНК, идея первичности РНК в происхождении жизни получила сильнейший толчок к развитию, и была сформулирована концепция самодостаточного мира РНК, предшествовавшего современной жизни

Абиогенный синтез рибонуклеотидов и их ковалентное объединение в олигомеры и полимеры типа РНК могли происходить приблизительно в тех же условиях и в той же химической обстановке, что постулировались для образования аминокислот и полипептидов.

Упаковка ДНК в хромосомах

В клетках или вирусах ДНК, по-видимому, никогда не находится в свободной, вытянутой форме. Она связана с низкомолекулярными катионами — ионами двухвалентных металлов либо с ди- и полиаминами или белками, а возможно, с теми и с другими. Взаимодействие осуществляется с помощью электростатических сил — отрицательно заряженные фосфатные группы частично нейтрализуются положительно заряженными ионами металлов и полиаминами или основными аминокислотными остатками белков. В результате таких взаимодействий происходит конденсация ДНК с уменьшением объема, занимаемого молекулой, иногда в тысячу раз. Кольцевая ДНК Е. coli длиной 1,4 мм заключена в клетку, имеющую форму палочки диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм; у эукариотических клеток ядерная ДНК длиной почти 2 м в стадии интерфазы заключена в ядре диаметром менее 10 мкм. Ядерная ДНК в клетках, находящихся в стадии митоза, конденсирована еще больше и в световом микроскопе имеет вид очень компактной структуры.

Хромосомы эукариот. Хромосомы эукариотических клеток состоят в основном из хроматина — комплекса двухцепочечной ДНК и пяти гистоновых белков, обозначаемых H1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Гистоны могут быть ацетилированы, метилированы, фосфорилированы, роlу(АDР)-рибозилированы, а гистоны Н2А и Н2В — ковалентно связаны с белком, называемым убиквитином. Какова роль воздействия указанных компонентов на структуру и функции гистонов — до конца не выяснено. Гистон H1 млекопитающих состоит из примерно 215 аминокислот; размеры других гистонов варьируют от 100 до 135 аминокислот. Все они содержат необычно большое количество положительно заряженной аминокислоты лизина; Н3 и Н4 отличаются от других тем, что у них достаточно высок уровень положительно заряженной аминокислоты аргинина. Соотношение между Н2А, Н2В, Н3 и Н4, содержащимися в хроматине низших эукариот (дрожжи, плесневые грибы), такое же, как в хроматине млекопитающих.

На электронно-микроскопических фотографиях в зависимости от условий выделения и степени растяжения хроматин выглядит либо как длинное волокно диаметром 10 нм, либо чаще как более вытянутое волокно с утолщениями — «бусинками» диаметром 10 нм, нанизанными по всей длине волокна с определенными интервалами.

Каждая из этих бусинок представляет собой нуклеосомный кор, на который намотан сегмент хромосомной ДНК длиной 145 пар оснований. Кор — это гистоновый октамер, состоящий из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, по две молекулы каждого вида.

 

Рис. Модель нуклеосомного кора, построенная по данным кристаллографического анализа низкого и высокого разрешения.

Сегмент ДНК (145 пар оснований), изображенный в виде трубки, обвивает гистоновый октамер, делая вокруг него 1³/₄ оборота

 

Молекула ДНК, обвиваясь 1³/₄ раза вокруг нуклеосомного кора, образует сверхспираль.

Пятый гистон, H1, не входит в состав нуклеосомного кора и не участвует в процессе наматывания ДНК на гистоновый октамер. Он контактирует с ДНК в тех местах, где двойная спираль входит и выходит из нуклеосомного кора.

Рис. Гистон Н1 «сшивает» ДНК в местах, где она начинает и прекращает наматываться на нуклеосомный кор

В такой структуре с одним гистоновым октамером и молекулой гистона H1 ассоциированы 168 пар оснований спиральной ДНК. Как мы уже отмечали, на электронно-микроскопических фотографиях хроматин часто обнаруживается в двух альтернативных формах: в форме волокна с четко разделенными нуклеосомами (нуклеосомы имеют вид бусинок, нанизанных на нитку) или в форме волокна диаметром 10 нм, в котором нуклеосомы упакованы бок о бок по всей его длине. Волокно диаметром 10 нм может подвергаться дальнейшей конденсации с образованием структур более высокого порядка. При этом нуклеосомы, по всей видимости, образуют соленоид — структуру диаметром 30 нм.

Рис. Структура хроматина с разной степенью конденсации.

В нижней части рисунка представлен хроматин, находящийся в растянутой форме; он имеет вид нити с нанизанными на нее бусинками.

Далее изображен хроматин в частично конденсированной форме, представляющий собой волокно диаметром 10 нм.

В верхней части рисунка представлен хроматин в наиболее конденсированном состоянии, когда волокно диаметром 10 нм образует соленоид диаметром 30 нм.

Обратите внимание на взаимодействие молекул гистона Н1, связанных с каждой нуклеосомой, которое способствует конденсации волокна диаметром 10 нм в более плотную структуру

В результате взаимодействия ДНК с гистонами сегмент двойной спирали ДНК из 168 пар оснований со средним диаметром 2 нм и длиной 57 нм превращается в спираль диаметром 10 нм и длиной 5 нм. При последующем сжатии этой спирали до волокна диаметром 30 нм степень конденсации увеличивается еще в шесть раз. Таким образом, упаковка дуплекса ДНК с пятью гистонами приводит к 50-кратной конденсации ДНК. Однако даже столь высокая степень конденсации не может объяснить почти 5000-кратное уплотнение ДНК в метафазной хромосоме.

Эукариотический хроматин содержит и другие белки, которые обычно называют негистоновыми. Некоторые из них, например ферменты, необходимые для репликации и экспрессии ДНК, могут связываться с хроматином временно. Белки, принимающие участие в различных процессах регуляции, связываются с ДНК только в специфических тканях или на определенных стадиях дифференциации. Все эти вопросы, а также роль альтернативных способов организации хроматина в процессах репликации и экспрессии мы детально рассмотрим в последующих главах.

Хромосомы прокариот. Насколько известно, в упаковке прокариотической геномной ДНК участвуют только два или три белка. О природе взаимодействия этих белков с ДНК и о структуре конденсированного комплекса белокнуклеиновая кислота известно немного. У Е. coli, по-видимому, существует лишь один белок или один класс ДНК-связывающих белков, называемых HU-белками; по своему размеру, содержанию лизина и аргинина, антигенным свойствам они сходны с эукариотическим гистоном Н2А. Другой белок, белок II, обнаруженный у Е. coli и цианобактерий, по повышенному содержанию лизина и ДНК-связывающим свойствам также напоминает эукариотический гистон. Белки HU и II обнаружены в количествах, достаточных для образования комплекса по крайней мере с половиной ДНК Е. coli и, по-видимому, совместно с полиаминами и еще неизвестными нам белками могут осуществлять те же самые функции при конденсации и упаковке ДНК, что и пять эукариотических гистонов.

 

11.

 

13.

Интроны генов ядерных мРНК

Интроны генов ядерных мРНК находятся в ядерных генах кодирующих белки.

Их размер варьирует от 100 п. н. до 10 т. п. н. и более.

Наиболее характерной отличительной чертой всех интронов данной группы является наличие специфических последовательностей вблизи их 5`- и 3`-концов.

Нуклеотидные последовательности в местах соединения экзонов и интронов весьма консервативны и практически одинаковы во всех генах ядерных мРНК.

 

ТОЖЕ НА ВСЯКИЙ СЛУЧАЙ

Типы интронов.

Особые типы интронов:

Группа I.

Гены ядерных рРНК некоторых низших эукариот содержат особые интроны и имеют уникальный механизм сплайсинга. Подобные интроны обнаружены во многих генах, но ни один из них не был выявлен в генах позвоночных.

Интроны группы I отличаются друг от друга по размеру, они имеют ряд общих свойств:

А) они сами катализируют свой сплайсинг, который может протекать in vitro в отсутствии каких-бы то ни было белков;

Б) информация, необходимая для сплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних последовательностей внутри интрона, которые обеспечивают укладку молекулы с образованием характерной пространственной структуры.

В) сплайсинг инициируется свободным гуанозином или любым из его 5`-фосфорелированных производных

Г) конечными продуктами сплайсинга являются рРНК и линейная РНК, размер которых несколько меньше, чем размер интрона.

Самосплайсинг интронов группы I. про-рРНК, прототип интрона группы I осуществляется при участии последовательных реакций трансэтерификации, в которых акты фосфодиэфирного обмена не сопровождаются гидролизом. (прозрачка 28).

Группа II.

Интроны группы II распространены менее широко. Они обнаружены в двух митохондриальных генах дрожжей, кодирующих одну из субъединиц цитохромоксидазы и цитихром b; интересно, что в этих генах присутствуют также интроны группы I.

Сплайсинг интронов группы II. Интроны группы II также подвергаются самосплайсингу in vitro, но в этом случае реакция инициируется не экзогенным гуанозином, а остатком входящим в состав самого интрона (прозрачка 29) Интроны группы II, высвобожденные после сплайсинга представляют собой лассоподобные структуры, в которых 5`-концевой фосфат РНК интрона соединен фосфодиэфирной связью с 2`-гидроксильной группой внутреннего нуклеотида.

 

Сплайсинг и его виды.

Сплайсинг (splicing - англ. splice — сращивать, соединять) - процесс реорганизации молекул нуклеиновых кислот и белков, протекающий после их первичного синтеза, который заключается в вырезании из длинной молекулы отдельных фрагментов и ковалентного соединения между собой остающихся.

1) Сплайсинг РНК: эксцизия (вырезание) из молекулы пре-РНК (первичный транскрипт) участков, транскрибированных с интронов (и спейсеров), и лигирование нуклеотидных последовательностей, транскрибированных с экзонов, завершающиеся формированием зрелой молекулы РНК. Этот процесс является частью посттранскрипционной модификации РНК (см.Процессинг). РНК-сплайсинг в основном представляет собой двухступенчатый процесс; обе реакции катализируются сплайсосомами. На первой стадии происходит разрыв в 5'-донорном сайте интрона с формированием структуры, подобной лассо, а затем следует разрыв 3'-акцепторного сайта интрона и сшивка экзонов; оба этапа сплайсинга имеют трансэстерификационный механизм. Сплайсинг РНК обнаружен в 1978 г. П. Шарпом и Р. Робертсом (Нобелевская премия за 1994 г.).

2) Сплайсинг ДНК: рекомбинационный процесс генов иммунной системы, включающий образование двунитчатых разрывов и лигирование нуклеотидных последовательностей в новых комбинациях; ДНК-сплайсинг ведет к перегруппировке генов, благодаря таким рекомбинациям создается разнообразие иммуноглобулинов (антител).

3) Сплайсинг белка: вырезание из белка-предшественника интеинов и соединение экстеинов с образованием зрелого белка. Процесс сплайсинга белка нашел применение в биотехнологии для очистки рекомбинантных белков и для получения полусинтетических белковых продуктов. Впервые сплайсинг белков описан Т. Стивенсом с соавт. в 1990 г. у дрожжей.

 

Альтернативный сплайсинг (alternative splicing) [франц. alternative, от лат. alter — один из двух; англ. splice — сращивать, соединять] — непоследовательное в плане расположения в гене лигирование нуклеотидных последовательностей РНК-предшественника, транскрибированных с экзонов и интронов гена, с образованием зрелой мРНК, которая по структуре и кодируемой ею информации отличается от обычной, нормальной. В результате А.с. один ген может кодировать несколько различных по структуре и функции белков. В среднем каждый ген человека способен обеспечивать синтез трех различных мРНК (т. е. кодировать 2—3 отличающихся друг от друга белка). Напр., в результате А.с. первичного продукта транскрипции гена кальцитонина образуются две разных мРНК, одна из которых накапливается в щитовидной железе и обеспечивает синтез кальцитонина, а другая — в гипоталамусе, где кодирует синтез пептида, родственного кальцитонину, но отличающегося от него по функции.

Сущность альтернативного сплайсинга заключается в том, что в результате посттранскрипционного процессинга предшественника мРНК, из которого в результате сплайсинга вырезаются некодирующие последовательности нуклеотидов, соответствующие интронам транскрибированного гена, образуются зрелые мРНК, различающиеся по своей первичной структуре. В результате в разных клетках из одного и того же предшественника получаются молекулы зрелых мРНК, которые объединяют в различных комбинациях последовательности экзонов транскрибированного гена.

Транс-сплайсинг (trans-splicing) [лат. trans — сквозь, через и англ. splice — сращивать, соединять] — сплайсинг (см. Сплайсинг), происходящий между двумя разными молекулами РНК или белка. При Т.-с. РНК сплайсосома (см. Сплайсосома, сплайсома) выбирает для объединения 5'-сайт и 3'-сайты сплайсинга, расположенные на разных молекулах РНК, в результате чего объединяются в одну молекулу нуклеотидные последовательности РНК, транскрибированные с разных генов. В основе Т.-с. РНК лежат те же молекулярные механизмы, которые функционируют при внутримолекулярном сплайсинге. Последовательности нуклеотидов сайтов транс- и цис-сплайсинга идентичны и взаимозаменяемы в генно-инженерных экспериментах. Т.-с. обнаружен у простейших (трипаносом), евглен, нематод и плоских червей, а также в митохондриях, хлоропластах и безрибосомных пластидах высших растений. Т.-с. белка основан на том факте, что при искусственном разделении интеинов (см. Интеин) на две части каждая из них сама по себе не обладает ферментативной активностью, однако после их нековалентного объединения комплекс активируется. При одновременной экспрессии обеих частей интеина в одной клетке происходит спонтанный Т.-с. белков. С помощью Т.-с. белков получают полусинтетические белковые продукты, изучают белок-белковые взаимодействия, осуществляют синтез циклических пептидов и др. Впервые Т.-с. пре-мРНК был описан у трипаносомы В. Мурфи с соавт. в 1986 г.

 

Нестабильность генома.

Источники геномной нестабильности только недавно были выяснены. Высокая частота внешне причиняемого ущерба ДНК может быть одним из источников геномной нестабильности, так как повреждения ДНК могут привести к неточнму синтезу сквозь повреждения или ошибкам репарации, приводящим к мутации. Еще одним источником геномной нестабильности может быть эпигенетическое или мутационное снижение экспрессии генов репарации ДНК. Поскольку эндогенные (вызванные (метаболизмом) повреждения ДНК очень часты, в геномах клеток человека происходят в среднем более чем 60.000 раз в день, любое снижение репарации ДНК, вероятно, является важным источником геномной нестабильности.

В клетке имеются специализированные системы контроля целостности генома, нарушения работы которых характерны для опухолевых клеток.

Системы контроля целостности генома условно можно разделить на две группы:

1) репарационные системы, выявляющие и исправляющие ошибки, которые приводят к изменениям последовательности нуклеотидов в ДНК, и

2) системы контроля клеточного цикла, предотвращающие размножение клеток, в которых уже произошли или могут произойти нарушения структуры или числа хромосом.

Часто встречающиеся в новообразованиях человека изменения опухолевых супрессоров (инактивацияр53, pRb и, возможнo, p16INK4a - p19ARF) и/или протоонкогенов (активация Myc, Ras и, возможно, других) приводит к дисфункции сверочных точек клеточного цикла и нестабильности генома. Кроме того, в опухолевых клетках закономерно выявляются изменения и некоторых других генов, ответственных за поддержание целостности генома. Врожденные инактивирующие мутации не только р53 или pRb, но и некоторых из генов репарационных систем неизменно приводят к развитию определенных новообразований. Это свидетельствует о важнейшей роли генетической нестабильности в генезе опухолей и/или их дальнейшей прогрессии. Хотя повышенная нестабильность генома, вероятно, не является строго необходимой для онкогенеза, без нее практически невозможно возникновение в одной клетке достаточного числа мутаций, определяющих злокачественный характер роста солидных опухолей. Создавая гетерогенность клеточных популяций, генетическая нестабильность постоянно предоставляет материал для отбора все более и более автономных и агрессивных клеток.

 

Транспозоны эуариот.

Ретротранспозоны.

Геном. Размеры генома.

Гено́м — совокупность наследственного материала, заключенного в гаплоидном наборе хромосом клеток данного вида организмов.

Состав генома прокариот- 1. Кодирующие последовательности генов,2. Нетранслируемые области генов: 5’ – и 3‘ – концевые районы, интроны. 3. Регуляторныйе элементы генома: промоторы, терминаторы транскрипции, сайты связывания регуляторных белков, сайты связывания рибосом, сайты связывания с клеточными мембранами.4. мобильные элементы. Интегроны. 5. Профаги и интегрированные в хромосому плазмиды. 6. CRISPR – структуры.

Большую часть генома прокариот составляют последовательности, кодирующие белки и РНК. Интроны у бактерий и архей встречаются как в генах, кодирующих рибосомные и транспортные РНК, так и белок- кодирующих генах. Однако частота встречаемости интронов в генах прокариот гораздо ниже, чем у эукариот. Геномы прокариот являются динамичными даже в пределах одного вида. Полученные путем секвенирования генома одного конкретного штамма сведения не позволяют говорить о геноме всего вида из-за штаммовых различий в генном составе и размерах геномов.

Разнообразие геномов-1. Чёткая корреляция между размером генома и генетической сложностью отсутствует. 2. Минимальный размер генома возрастает пропорционально увеличению сложности организма. 3. Размеры геномов могут сильно варьировать даже в пределах одного таксона.

 

IS-элементы – это сегменты ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка локализации в другой. IS – элементы содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения – транспозиции.

Транспозон – сегмент ДНК, обладающий теми же свойствами, что и IS – элементы, но содержащие также гены, не имеющие непосредственного отношения к транспозиции (гены устойчивостик антибиотикам, гены токсинов…)

Парадокс С это несоответствие между размером генома и фенотипической сложностью организма. Суммарное содержание ДНК в гаплоидном наборе различных организмов отличается более чем в 200000 раз.

Минимальный размер генома в пределах филогенетической группы увеличивается от прокариот к млекопитающим.

 

Парадокс N это большие различия в фенотипической сложности высших эукариот, имеющих приблизительно одинаковое число генов. Уникальная комбинаторика объединения экзонов в филогенезе и во время экспрессии – может объяснить парадокс N. Многочисленные экспериментальные доказательства переводят феномен в разряд нерешённых проблем функционально-значимых некодирующих нуклеиновых последовательностей.

Строение эукариотических геномов: уникальные и повторяющиеся последовательности- Кинетика реассоциации молекулы ДНК после денатурации позволяет разделить последовательности по частоте их встречаемости в геноме. Подавляющее большинство генов – это уникальные для генома последовательности. В пределах одного таксона более крупные геномы содержат не большее число генов, а большее число повторяющихся участков ДНК. Существенная часть повторяющихся участков ДНК представляет собой транспозоны.

 

В эукариотических геномах соотношение различных компонентов последовательности сильно варьирует. Общий размер уникальных последовательностей ДНК возрастает с увеличением размера генома, достигая плато на уровне = 2*109.

Только 1% генома человека состоит из кодирующих регионов. 2. Экзоны составляют около 5% от общей длины гена; сами гены (экзоны и интроны) составляют около 25% генома. 3. Геном человека содержит от 20000 до 25000 генов. 4. Около 60% генов человека могут экспрессироваться по механизму альтернативного сплайсинга. 5. До 80% случаев альтернативного сплайсинга приводят к изменению последовательности белка, таким образом протеом человека представлен 50000-60000 различных полипептидных цепей.

 

 

Гены, кодирующие тРНК.

Гены разных тРНК (в эукариотической клетке насчитывается 40-60 основных типов тРНК) часто сгруппированы в кластеры, расположенные в разных хромосомах. Характер организации генов тРНК в составе таких блоков сильно варьирует у разных организмов. В целом организация генов тРНК в кластерах не столь регулярна, как в случае рибосомальных РНК: направление транскрипции близлежащих генов бывает противоположным, а гены могут быть разделены нерегулярными промежутками, включающими 100-150, а иногда и несколько тысяч нуклеотидных пар. Природа и функции участков ДНК, разделяющих гены тРНК, не выяснены.

Внутри генов тРНК обнаружены два района, необходимые для того, чтобы осуществилась правильная и эффективная транскрипция. Например, для одного из исследованных генов тРНК это области, кодирующие нуклеотиды 8-25 и 50-58 молекулы тРНК. Два участка такого "расщепленного промотора " совпадают с районами гена, которые соответствуют наиболее консервативным районам молекул тРНК в дигидроуридиловой (D) и псевдоуридиловой (T) петлях, содержащих наибольшее количество инвариантных нуклеотидов. Для активной транскрипции требуется сохранность расстояния между районами D и T промотора, которое составляет