Определение содержания фитогормонов

Нектар собирали капиллярным методом или использовали для данной работы пчел. Для этой цели отбирали сильную пчелиную семью, которую размещали её в непосредственной близости от изучаемого медоноса за несколько дней до сбора нектара. Формировали гнездо пчелиной семьи следующим образом: накануне сбора нектара с помощью рамок заполненных медов максимально укомплектовывали гнездо за исключением места для одной рамки, которая не содержит меда. Рано утром устанавливали данную рамку для сбора нектара пчелами и вечером после захода солнца отбирали данную рамку. С помощью микропипетки собирали нектар из сотов и замораживали при температуре – 18 ºС и ниже. Для проведения анализов необходимо не менее 3-5 мл нектара. Сбор пыльцы проводят с помощью пыльцеуловителей, отбирали среднею пробу по общепринятым методикам. Перга извлекалась из сот, замораживалась, отмывалась от меда и воска, затем сушилась. Для проведения анализов необходимо не менее 3 г пыльцы или перги. Отбор средней пробы меда проводили стеклянной палочкой. Для проведения анализов необходимо не менее 5 г меда.

Определение фитогормонов проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) по модифицированной нами схеме (Фархутдинов и др., 2010).

Для изучения путей распространения аскосфероза нами была разработана следующая схема исследований:

Пчелиные семьи с клиническими признаками аскосфероза выявляли в период проведения весенней ревизии (начало мая) пасеки. Для проведения микроскопических исследований и выделения чистой культуры гриба в стерильные пробирки было отобрано по 10-15 мумифицированных личинок, которые гомогенизировали и просматривали в световом микроскопе при увеличении х 400. При наличии в поле зрения характерных для A.apis шаров, заполненных спорами, делали посев гомогената на картофельно-декстрозный агар с дрожжевым экстрактом (Жуков, 1995). Идентификацию выросших колоний гриба проводили по общепринятым методикам.

При изучении микобиоты растительного объекта был выбран одуванчик лекарственный (Taraxacum officinalis L.), обильно произрастающий на территории продуктивного лёта пчёл. Собирали распустившиеся цветки (10 шт.) в стерильные колбы объемом 100 см³, заливали их 20 см³ стерильного физиологического раствора, аккуратно встряхивали колбу в течение 2-3 минут, полученные смывы переносили в центрифужные пробирки, центрифугировали при 2000 об/мин – 15 минут, надосадки сливали, а осадки использовали для посева на питательные среды по общепринятым методикам.

Пыльцевая обножка отбиралась по цвету (Фархутдинов и др., 2010), для подтверждения выборочно проводился пыльцевой анализ с помощью микроскопа и сравнивали наблюдаемое изображение со стандартом пыльцы одуванчика. Пыльцевая обножка (около 10 г), взятая из пыльцесборника, измельчалась в фарфоровой ступке и 1 мл взвеси распределялся по поверхности питательной среды и посевы помещались для культивирования в термостат.

Оценку степени зараженности рабочих пчёл больных семей спорами гриба проводили отлавливая фуражирующих пчел у летков по 10 шт. в стерильные пробирки. Для обездвиживания их помещали в морозильную камеру холодильника на 20-30 минут, затем заливали 5 мл стерильного физиологического раствора, делали смывы, центрифугировали как указано выше, и полученные осадки высевали на питательные среды.

Выделение спор гриба A.apis из меда проводили согласно «Методическим рекомендациям по изучению и разработке способов профилактики и борьбы с аскосферозом пчел» (1987). Известно, что по встречаемости в микобиоте пыльцевой обножки доминирует род Aspergillus, а к случайным относится род Ascosphaera (Осинцева, Чекрыга, 2008). Так как в нашей работе мы проводили экспресс-тестирование по определению количества зараженных микозами объектов в изучаемой нами системе, мы допускаем возможность ошибки в определении количества зараженных объектов только родом Ascosphaera или комбинированно родами Aspergillus + Ascosphaera. Более того, как показывают данные литературы и наши наблюдения, оба возбудителя часто действуют сочетанно.

Статистическую обработку проводили по стандартным программам MS Excel. Все эксперименты повторяли не менее трех раз. На графиках и в таблицах указано количество биологических повторений (n), приведены средние значения показателей и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние автомобильного загрязнения на содержание тяжелых металлов в продуктах пчеловодства и биоаккумуляция их в трофической цепи «почва – растение – пчела – мёд»

Медоносная пчела является уникальным индикатором загрязнения окружающей среды (Смирнов А.М., 1993; Колбина Л.М., 2009; Осинцева Л.А. и др. 2009). Это связано с тем, что в течение одного дня одна пчела облетает территорию площадью 1256 га вокруг пасеки. К тому же, отбор проб пчел и продуктов пчеловодства не представляет трудностей и не наносит ущерба популяции. Изучение пчел в качестве биоиндикатора загрязнителей окружающей среды; анализ трофической цепи «почва—медоносное растение - продукты пчеловодства» позволяют оценить качество и безопасность продуктов пчеловодства, и экологическое состояние местности.

Часто многие пасеки располагаются вблизи автомагистралей, таким расположением владельцы пасек обеспечивают себе хорошие подъездные пути. Придорожные экологические системы – биотопы, активно загрязняются тяжелыми металлами, попадая туда через выхлопные газы, образующиеся при работе двигателей внутреннего сгорания.

Нами были проведены исследования по движению ТМ в трофической цепи питания пчелы медоносной (почва – растение – пчела - продукты пчеловодства). При оценке проб на содержание ртути во всех пробах не было обнаружено достоверных значений в исследуемых материалах, поэтому эти данные не обсуждаются в данной работе.

Наибольшее содержание ТМ в исследуемой трофической цепи было установлено в почве придорожных биотопов (рис 1). Как и предполагалось, почвы у автомагистрали М5 (проба 1) наиболее загрязнены ТМ Превышение содержания свинца по сравнению с контрольным вариантом (проба 3) было на 49 %, кадмия – на 350 %, железа – на 19 %, цинка – на 105 %, меди – на 24 %. Таким образом, почвенное загрязнение было наиболее выраженным по свинцу, кадмию и цинку. Сравнение почв по содержанию ТМ пробы 2 и контроля показало, что свинца больше на 53 %, кадмия – на 200 %, железа – на 11 %, цинка – на 94 %, меди – на 18 %.

Определение содержания ТМ в растениях гречихи показало, что существует избирательность поглощения ТМ. Известно, что существует избирательность в поглощении ионов корнями (почва→корень) и в выделении нектара (цветок→пчела) (Люттге У., Хигимботам Н., 1984). Наглядно демонстрирует количество вещества, поступившего в растение, индекс аккумуляции. По нашему предположению, в том случае, когда J_а был меньше единицы, это свидетельствует о существовании защитных барьеров, в частности, на пути проникновения ТМ в растение из почвы. Наименьший J_а наблюдался в наиболее загрязненном ландшафте (ИА_ср таблица 1). Из литературы известно, что в летние месяцы наблюдаются максимальные концентрации свинца в надземной части растений, весной – цинка, а осенью – меди и железа (Башмаков, Лукаткин, 2002). Учитывая также, что товарный мед получают в летние месяцы, проведение анализа содержания свинца в мёде чрезвычайно актуально.

Определение содержания ТМ в теле пчелы показало на интересную функцию пчел в миграции данных элементов в трофической цепи. Нами наблюдалось накопление ТМ в теле пчел, порой превышающее даже содержание веществ в почве, например, содержание кадмия, цинка и меди. Значение ИА было больше единицы, что также свидетельствует о накоплении вещества в данном участке цепи (табл. 1). Так, в пробе 1 (рис. 1) содержание кадмия и цинка в теле пчелы более чем в 1,9 и 3,7 раза соответственно превышало их концентрацию в грунте. В пробах 2 и 3 наблюдалась близкая картина. Количество железа и меди в теле пчел хотя и было меньшим, чем в почве, однако и оно превышало их концентрацию в растениях. Содержание свинца в теле пчел, в отличие от других ТМ, снижалось, т.е. эффекта кумуляции не наблюдалось. Определение ИА_ср показало, что аккумуляция ТМ в теле пчел возрастает у содержащихся рядом с наиболее загруженной автомагистралью (проба 1). Общим для всех вариантов опытов является то, что организм пчелы является биоаккумулятором ТМ.

Оценка содержания ТМ в гречишном мёде показала, что мёд в пробе 1 не соответствовал требованиям СанПин – 2.3.2.1078-01 (п.1.5.6), а содержания кадмия было на уровне допустимых концентраций (рис. 1). Остальные пробы соответствовали требованиям нормативного документа на мед.

Интересным на наш взгляд было определение коэффициента перехода вещества (КПВ) ТМ из почвы в мёд. Этот показатель свидетельствует о том, какая доля вещества, имеющегося в почве, достигает конечного продукта изучаемой нами трофической цепи. Коэффициент перехода ТМ от пчелы к мёду как видно из таблицы 1 во всех вариантах был ниже единицы, что говорит о существовании защитных барьеров на пути движения ТМ от пчелы к меду. Проследим динамику движения ТМ в трофической цепи (табл. 1), так, КПВ свинца и кадмия был достаточно высок в пробе 1, соответственно 9,1 % и 5,5 %. Однако в пробах 2 и 3 КПВ этих токсичных элементов снижался у свинца до 3,7 % и 2 %, а кадмий не был обнаружен в мёде и соответственно его КПВ был равен нулю. Доля биогенных микроэлементов (Fe, Zn, Cu), преодолевших барьеры на пути их транзита в мёд, была различной (табл. 1).

Количество железа, которого очень много в почве, достигающего мёд была во всех пробах невелико и не превышало 1 %. В пробах мёда 1 и 2 нами было установлен достаточно высокий уровень содержания меди, что видно из значения КПВ 13,25 % и 10,1 % соответственно, а в пробе 3 лишь 3,2 %. Доля транзитного цинка в мёде особенно велика, так в пробе 1 – 18,9 %, во 2 – 10,3 % и в 3 – 16,6 %. Неоднозначность количества вещества, достигающего меда, в некоторых случаях, вероятно, связана с сопряженностью их транспорта, разной степенью аккумуляции в тканях растений и пчёл, однако нам каких-либо коррелятивных связей установить не удалось.

 

Рис. 1. Изменения уровня содержания свинца, кадмия, железа, цинка, меди в зависимости от нахождения кочевых пасек от автодорог с разной интенсивностью движения. Проба 1 взята у трассы 1 категории загруженности, проба 2 у трассы 3 категории и проба 3 контроль. Каждая проба в своем составе имеет значения (слева → направо) уровня содержания ТМ в почве, растении, теле пчелы и мёде.

Таблица 1 Индекс аккумуляции (ИА) и коэффициент перехода веществ (КПВ) в пробах 1, 2, 3.

 

№	Металлы	Индекс аккумуляции	КПВ,%
Почва → растение	Растение → пчела	Пчела → мёд
Проба 1	Свинец	0,57	0,6	0,30	9,1
Кадмий	0,45	4,25	0,03	5,5
Железо	0,4	1,28	0,02	0,9
Цинк	0,46	8,06	0,05	18,9
Медь	0,41	2,41	0,02	13,3
ИАср	0,46	3,32	0,09	КПВ ср 9,6
Проба 2	Свинец	0,58	0,43	0,15	3,7
Кадмий	0,67	1,5		-
Железо	0,56	0,87	0,006	0,3
Цинк	0,51	8,47	0,03	10,3
Медь	0,63	2,0	0,8	10,1
ИАср	0,6	2,65	0,2	КПВ ср 4,9
Проба 3	Свинец	0,54	0,55	0,07
Кадмий	0,75	2,33		-
Железо	0,55	0,9	0,02	0,47
Цинк	0,5		0,5	16,6
Медь	0,48	2,25	0,03	3,2
ИАср	0,56	2,6	0,12	КПВ ср 4,5