Ліпідний бішар притягує гідрофобні білки

АСИМЕТРІЯ МЕМБРАН

Трансмембранна асиметрія мембрани свідчить про те, що різні половини бішару має різний склад. Встановлено, що інтегральні мембранні білки вмонтовані в мембрану АСИМЕТРИЧНО і ця асиметрія є стабільною.

Існують дані про латеральну гетерогенність біологічних мембран, це можуть бути досить значні спеціалізовані ділянки мембрани.

 

ДИНАМІКА МЕМБРАН

Багато мембранних білків здатні до динаміки.

Однак рухи білків частково є обмежені через взаємодію з цитоскелетом та з іншими мембранними білками.

Рухливість мембранних білків показали на експериментальному змішуванні мембранних білків клітини миші та людини, з додаванням флоресцентної мітки.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ МЕМБРАННИХ БІЛКІВ

Для вивчення мембранних білків використовують метод солюбілізації, за допомогою детергентів було очищено багато мембранних білків. Наприклад, фоторецепторний білок родопсин з клітин сітківки, Са2+-АТФазу з саркоплазматичного ретикулуму.

Детергенти – амфіфільні структури, котрі як і ліпіди, складаються з полярної головки і гідрофобного хвоста.

Детергенти поділяють на три категорії:

1) Іонні – катіонні чи аніонні (приклад, ДСН) – екстрагують білки з мембран, здатні до денатурації.

2)Неіонні – (приклад, Тритон Х-100) – екстрагують білки з мембран, не здатні до денатурації, використовують переважно в кристалографії

3)Цвітеріони – (приклад, CHAPS) – містять у своєму складі позитивний та негативний заряди, не діють як іонні детергенти.

Для кожного детергенту характерна Критична Концентрація Міцелоутворення (ККМ) – концентрація детергенту, коли всі молекули задіяні в утворені міцел.

Детергенти використовують в таких методах дослідження:

1. Діаліз;

2. Гель-проникаюча хроматографія в колонках;

3. Електрофорез;

МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ Й АНАЛІЗУ БІЛКА

ДІАЛІЗ

Використовують для виділення низькомолекулярних домішок або заміни складу середовища

ХРОМАТОГРАФІЯ

Гель-проникаюча хроматографія дозволяє розділяти білки за розміром і формою молекул. Поділ проводять у хроматографічних колонках заповнених сферичними частинками набухлого гелю із полімерних матеріалів. Білкові молекули, які не здатні проникати в гранули гелю, будуть переміщатися з високою швидкістю.

Середні та невеликі білки будуть утримуватися гранулами гелю

Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності

додецилсульфату натрію

Метод базується на властивості заряджених часток (молекул) переміщатися під дією електричного поля

Електрофорез проводять у тонкому шарі поліакриламіду

МЕТОД ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

Електрофорез.

Електрофорезом називається рух частинок в рідині під дією електричного поля.

На макромолекулу із сумарним зарядом Q в електричному полі напруженістю Е діє електрична сила Fе:

а – комплекс поліпептидного ланцюга (1) з молекулами ДСН (2);

б – експериментально встановлено лінійний зв'язок між електрофоретичною рухливістю U й логарифмом молекулярної маси М (контрольні білки);

U=b-a·lgM

Кожна молекула ДСН має один негативний заряд, звідси загальна густина заряду приблизно однакова для різних білкових поліпептидних ланцюгів. Отже, поверхнева шуба з ДСН усуває зарядові відмінності нативних білків.

Після денатурації поліпептид має вигляд витягнутого циліндра довжиною 1,8 нм.

Відношення V до напруженості електричного поля Е називається електрофоретичною рухливістю U (м2· с-1·В-1):

Під дією цієї сили відбувається прискорення руху макромолекул, що створює опір у в'язкому середовищі із силою тертя Fо =fV, де V- швидкість руху макромолекул; f- коефіцієнт внутрішнього тертя. Через певний період, коли сили врівноважуються (Fе= Fо), макромолекули рухаються рівномірно з постійною швидкістю V:

 

 

де η – в'язкість середовища;

r – радіус макромолекули.

 

 

Найкращим методом, за яким визначається молекулярна маса й субодиничний склад макромолекул, є електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (ДСН).

Експериментально встановлено, що за певних умов електрофоретична рухомість залежить від молекулярної маси й на цю залежність не впливає загальний заряд макромолекули. До цього білок обробляють 1% розчином ДСН, яки є детергентом, що денатурує білки, крім чого додають β-меркаптоетанол для розриву дисульфідних зв'язків (1,4 кг ДСН на 1 кг білка).

Одночасно проводять електрофорез досліджуваного білка та маркерних білків з відомою молекулярною масою й графічно зображають цю залежність.

ІНШІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Метод радіаційної інактивації використовують для визначення розміру мішені, суть методу полягає у визначенні долі білкових молекул, які отримали пошкодження при опроміненні.

Електрофізіологічні методи;

Мікроскопія:

Ú Заморожування-сколювання

(вугілля або Pt);

Ú Електронна та електронна скануюча;

Ú Флуоресцентна.

Також застосовують методи кругового дихроїзму, електронної мікроскопії, інфрачервону та раманівську спектроскопію, ЯМР.

ФУНКЦІЇ МЕМБРАННИХ БІЛКІВ

· Транспорт. (ліворуч) Білки, що пронизують мембрану наскрізь, формують гідрофільні канали, які селективні до певного виду іонів. (праворуч) Інші транспортні білки, в якості помп, використовуючи субстрат з цитоплазми клітини (наприклад, АТР), як джерело енергії, переносять молекули через мембрану.

· Ферментативна активність. Білки, які вмонтовані в мембрану володіють ферментативною активністю, і включені в ланцюг метаболізму.

· Передача сигналів. Мембранні білки на своїй поверхні

містять спеціалізовані ділянки (сайти) до хімічних месенджерів, наприклад, гормонів. Зовнішній месенджер (гормон) викликає конформаційні зміни білка зв'язуючись із спеціалізованою ділянкою, що реалізує передачі сигналу (інформації) всередину клітини.

· Клітинне впізнавання. Деякі глікопротеїди використовуються в якості якорів для клітинного впізнавання.

· Міжклітинна взаємодія. Мембранні білки, двох контактуючих клітин формують високоспеціалізовані структури – міжклітинні контакти.

· Взаємодія з цитоскелетом та матриксом. Мікрофіламенти та інші елементи цитоскелету можуть звязуватися з мембранними білками на своїй поверхні та стабілізувати локалізацію білків.

МЕМБРАННІ ВУГЛЕВОДИ

Ú Переважно олігосахариди;

Ú Різноманітний склад моносахаридів;

Ú Багато сіалової кислоти;

Ú Гліколіпіди;

Ú Глікопротеїни

Вуглеводи в мембрані становлять приблизно від
2-10% від загальної маси, переважно це сіалова кислота яка сполучена з білком глікофорином, збагачена вуглеводами периферична зона на поверхні більшості еукаріот має назву глікокалікс.

 

Приклади, гліколіпідів та глікопротеїдів у плазматичній мембрані, які формують глікокалікс.

Ú Відіграють ключову роль в cell-cell впізнаванні

– Здатність клітин впізнавати “потрібну” клітину

• antigens

– Важливі для тканинного &
органного розвитку

– Основа для відторгнення

клітин імунною системою

ЦИТОСКЕЛЕТ

Ú Інфраструктура клітини;

Ú Підтримання форми клітини

– Механічна підтримка

– Підтримка органел

Ú Рух

– Поділ клітини

ФУНКЦІЇ ЦИТОСКЕЛЕТУ

v Задіяний у розходженні хромосом під час мітозу і подальшого поділу клітин;

v Керує і направляє внутрішньоклітинний транспорт між органелами, переносячи матеріал від однієї частини клітини до іншої;

v Підтримує клітинну мембрану;

v Дозволяє деяким клітинам (сперматозоїди) плавати, а іншим (фібробласти і лейкоцити) переміщатися;

v Відповідає за скорочення м’язових клітин;

v Відповідає за ріст аксону та дендритів;

v Контролює ріст клітинної стінки рослинних клітин;

v Відповідає за різноманітність форми еукаріотичних клітин.

ЕЛЕМЕНТИ ЦИТОСКЕЛЕТУ

Ú Мікрофіламенти

– Взаємодіють з мембранними білками

– Активний рух

– Основний елемент м'язів

Ú Мікротрубочки

– Клітинний скелет

– Веретено волокна, війок

джгутиків

Ú Мікроворсинки

– Захищають поверхню клітин

– Збільшують поверхню

 

Актинові філаменти визначають форму поверхні клітини та є необхідними для переміщення усієї клітини. Але самі по собі ці філаменти неефективні. Їхня корисність для клітини залежить від цілого ряду допоміжних білків, які зв’язують ці філаменти з іншими компонентами клітини, як і з самими собою.

Проміжні філаменти забезпечують механічну стійкість і опір проти зовнішнього тиску.

Мікротрубочки визначають положення мембранних органел і прямий внутрішньоклітинний транспорт.