Банк in vitro и криоконсервация; их значение для сохранения генофонда растений

При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении.

Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной.

Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т.д.). Существует разные подходы к сохранению культур: криосохранение, замедление роста, распылительная или лиофильная сушка (для клеток микроорганизмов).

Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196^oC.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

- вид и тип клеток,

- их концентрация в суспензии,

- состав среды для консервирования,

- вид и концентрация криопротектора,

- режим охлаждения и отогрева,

- способ реабилитации клеток после отогрева.

Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.

Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*10⁵ - 5*10⁶ клеток в 1 мл.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:

· 2-6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;

· аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5%), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту;

· диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10% на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны;

· кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8+10^oC, а затем при +2+5^oC в течение 1 - 6 недель.

Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.

Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 - 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.

Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа:

- Первый этап - от +20 до -28^oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35^оС), выдерживают при этой температуре 15 минут;

- Второй этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196^oC).

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32^oC (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32^оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37+40^оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты.

После размораживания растительные клетки отмывают 3 - 10% раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.

 

Организация биотехнологической лаборатории

 

Оборудование биотехнологической лаборатории

И правила работы с ним

Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы. Для удобства проведения дезинфекции полы стены и потолок в помещениях должны иметь водостойкое и ультрофиолетоустойчивое покрытие.

Оборудование моечного помещения: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды – до 100-130^оС, для инструментов – до 170^оС; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H₂SO₄ 98 % + K₂CrO₇).

Оборудование помещения для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).

Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1-2 атмосферы и температура 120^оС; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.

Оборудование помещения для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования.

Оборудование культуральных помещений: световое отделение – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25±2^оС) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.

Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.