Определение фенольных веществ в сырье и готовых продуктах

Цель работы: Изучение классификации, строения, свойств фенольных веществ растительного сырья и готовой продукции. Освоение методов определения фенольных веществ в растительном сырье, вине, пиве.

 

Определение общего содержания фенольных веществ в вине, соке, фруктах и плодах

 

Необходимые реактивы и посуда:

Реактив Фолина-Чокальтеу, 20 % раствор натрия углекислого (Na₂CO₃), раствор энотанина, выделенного из семян винограда или танина (3мг танина растворяют в 100 см ³ 10 % об. спирта, рН 3,2).

Расход вина, сока 1см³ на один анализ.

 

Техника определения

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ белого вина, сока или 1 см ³ красного вина или темноокрашенного сока, предварительно разбавленного в 5 раз (2 см ³ красного вина ил сока и 8 см³ дистиллированной воды разводят в пробирке). Затем в мерную колбу добавляют 2 см³ реактива Фолина-Чокальтеу и 10 см³ 20 % раствора соды. Объем доводят водой до метки, перемешивают и выдерживают 30 минут. После выдержки в растворе определяют оптическую плотность раствора при λ= 630 нм, длина кюветы 10 мм на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. При значениях оптической плотности более 0,5 единиц анализируемый образец следует дополнительно разбавить, при этом разбавление следует учитывать в расчете содержания фенольных веществ. В качестве раствора сравнения используют реактив, приготовленный из 1 см ³ дистиллированной воды, 1 см³ реактива Фолина-Чокальтеу и 10 см³ 20 % раствора соды, доведенных в мерной колбе до 100 см³.

При анализе плодово-ягодного сырья вначале готовят вытяжку. На технических весах взвешивают 10 г сырья, растирают в фарфоровой ступке в течение 10 минут, постепенно добавляют при растирании 10 см³ воды. Измельченную навеску переносят количественно в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр. На анализ отмеривают 1 см³ в мерную колбу вместимостью 100 см³ и добавляют реактивы как указано выше. При определении общего содержания фенольных веществ в темноокрашенном сырье, например в черной смородине, приготовленный фильтрат необходимо разбавить в 5 раз, как красное вино, при этом разбавление следует учитывать в расчете содержания фенольных веществ.

Содержание фенольных веществ определяют по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика отмеривают по 1, 2, 5, 10, 20 см³ стандартного раствора энотанина в мерные колбы на 100 см³, что соответствует 0,3; 0,6; 1,5; 3,0; 6,0; мг/дм³ танина. В каждую колбу добавляют 1 см ³ реактива Фолина-Чокальтеу, 10 см³ 20 % раствора соды, содержимое колб доводят до метки, перемешивают. Через 30 минут выдержки определяют оптическую плотность растворов, при тех же параметрах. Используя полученные результаты, строят калибровочную кривую, откладывая на оси абсцисс содержание танина в исследуемых образцах, а на оси ординат – значение оптической плотности.

В отсутствии энотанина калибровочный график, с определенной погрешностью, вносимой используемым прибором, может быть построена по следующим данным:

ось абсцисс – 0,3; 0,6; 1,5; 3,0; 6,0; мг/дм³ танина;

ось ординат- 0,024; 0,046; 0,108; 0,214; 0,424; - значения оптической плотности.

Для расчета содержания фенольных веществ необходимо концентрацию танина, найденную по калибровочному графику, умножают на коэффициент разбавления: для красных вин и темноокрашенных соков – 500, а для белых вин и светлоокрашенных соков – 100. Для плодово-ягодного сырья коэффициент разбавления 10 в пересчете на 1 г сырья и 1000 в пересчете на 100 г сырья.

Пример: Для исследования использовали 10 г облепихи. Оптическая плотность исследуемого образца составила 0,045 ед, что соответствует по калибровочному графику 0,6 мг/дм³ танина. При учете разбавления это составит: 0,6 ·10 = 6 мг/г или 600 мг/100 г исходного сырья.

 

Определение рутина

 

Необходимые реактивы и посуда:

Реактивы и посуда аналогичны определению фенольных веществ см. раздел 4.1.

Расход вина, сока 1см³ на один анализ.

 

Техника определения

Рутин или Р-витамин является производным фловоноидов. Это гликозид, состоящий из фловонола или катехина, соединенный с дисахаридом рутинозой. Рутиноза, в свою очередь, состоит из глюкозы и рамнозы. Общее количество флавоноидов, обладающих Р-витаминной активностью, определяют колориметрическим методом, основанным на использовании реактива Фолина-Чокальтеу. Этот реактив окисляет фенольные группировки рутина, а сам восстанавливается до смеси окислов, окрашенных в голубой цвет. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию Р-витамина.

Для определения рутина может быть использовано вино, сок, плодово-ягодное сырье. Подготовка образцов к анализу аналогична предыдущему опыту, описанному в разделе 4.1. Для проведения анализа отмеривают 1 см³ исследованного образца в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 1 см³ реактива Фолина-Чокальтеу, 10 см³ 20 % раствора соды. Содержимое колбы доводят до метки, перемешивают, выдерживают 30 минут для стабилизации окраски, при этом раствор должен приобрести сине-голубую окраску. В растворе определяют оптическую плотность. При темно-синей окраске подготовленную вытяжку следует дополнительно разбавить в 5 – 10 раз дистиллированной водой, а при светло-голубой окраске на анализ берут не 1, а 5 – 10 см³ исследуемого образца.

Содержание рутина определяют по калибровочному графику. Навеску рутина 0, 02 г измельчают в ступке, смешивают с 10 см³ дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу на 100 см³, доводят до метки водой. 1 см³ приготовленного основного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, снова доводят до метки водой. Подготовленный рабочий раствор рутина используют для построения калибровочного графика. В 1 см³ такого раствора содержится 0, 002 мг рутина. Для построения калибровочного графика в мерные колбы на 100 см³ вносят: 2,5см³; 5 см³; 7,5 см³; 10 см³; 25 см³, что соответствует 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,05 мг/ см³ рутина. В каждую мерную в колбу добавляют по 1 см³ реактива Фолина-Чокальтеу, 10 см³ 20 % раствора соды, объем колб доводят до метки водой, перемешивают. Чрез 30 минут определяют оптическую плотность растворов, предварительно перемешав растворы. Цвет растворов должен быть от светло-голубого до синего. По результатам полученных измерений строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс - содержание рутина мг/ см³, а на оси ординат – значение оптической плотности растворов.

При отсутствии рутина калибровочный график, с определенной погрешностью, вносимой используемым прибором, может быть построена по следующим данным:

ось абсцисс: 0,005; 0,01; 0,015; 0.02; 0.05 мг/ см ³ рутина;

ось ординат: 0,025; 0,045; 0,085; 0,1; 0,34 – ед. оптической плотности.

 

Для расчета концентрации рутина в исследуемых образцах, следует концентрацию рутина, найденную по калибровочному графику, умножить на коэффициент разбавления.

Пример: оптическая плотность исследуемого образца составила 0,085 ед. для анализа было приготовлено следующее разведение: навеска сырья 10 г была разведена в 100 см³ воды, отфильтрована. Затем 10 см ³ фильтрата вновь разбавили до 100 см³. На анализ взято 5 см³ подготовленного образца. Следовательно, разведение составляет 20 раз на 1 г и 2000 раз на 100 г. По калибровочному графику 0,085 ед. оптической плотности соответствует 0,015 мг/см³ рутина. При учете разведения на 100 г исходного сырья содержание рутина составляет:

 

0,015 · 2000 = 300 мг/ 100 г.

 

 

4.3 Метод определения лейкоантоцианов в вине, соках

Необходимые реактивы и посуда:

Лецкоантоцианидиновый реактив (смесь н-бутилового спирта и концентрированной соляной кислоты в соотношении 3:1 и катализатор FeSO₄·7Н₂О из расчета 150 мг/дм ³).

Фотоэлектрокалориметр, кювета шириной 10 мм, ыодяная баня, плитка электрическая, пробирки с притертой пробкой вместимостью 20 см³, пипетки вместимостью 5 см³,

Расход вина или сока 1 см³, плодово-ягодного сырья 20-50 г на один анализ

 

Техника определения

В две градуированные пробирки с притертой пробкой объемом 20 см³ вносят по 1 см³ анализируемого вина или сока (красные вина и темноокрашенные соки предварительно разбавляют в 50 раз, мутные вина и соки фильтруют). В пробирки добавляют по 4 см³ лейкоантоцианидинового реактива. Одна пробирка служит контролем, а вторую закрывают притертой пробкой и нагревают в течение 30 минут в кипящей водяной бане. Затем пробирку охлаждают холодной водой и определяют оптическую плотность растворов в каждой пробирке на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны λ = 540 нм в кювете шириной 10 мм против лейкоантоцианидинового реактива.

Содержание лейкоантоцианов (мг/ дм ³) рассчитывают по формуле (4.1):

 

Х = (Д₂ – Д₁ ) · 104 ·п, (4.1)

 

где Д ₁ и Д₂ – оптическая плотность растворов до и после кипячения;

п - коэффициент разбавления;

104 - коэффициент, учитывающий величину молекулярной

экстинкции цианидина.