Разделить белки сыворотки крови методом высаливания.

Биуретовая реакция.

Принцип метода: реакция основана на способности пептидной группы белков и полипептидов образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной группы: -CO-NH- в исследуемом веществе и, следовательно, является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы. Свое название реакция получила от производного мочевины  биурета, который дает в данных условиях то же окрашивание, что и белок. Окрашивание появляется за счет образования медной комплексной соли.

Ход работы: в пробирку внести 5 капель 1 % раствора яичного белка, 3 капли 10 % раствора NaOH, 1 каплю 1 % раствора СuSO₄, перемешать. Отметить появление сине-фиолетового окрашивания.

Принцип метода: реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда солями щелочных и щелочноземельных металлов. Высаливание белков сернокислым аммонием широко используется для разделения белков друг от друга и получения их в кристаллическом виде. Например, глобулины сыворотки крови, имеющие большую молекулярную массу и меньший заряд легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины в насыщенном растворе сернокислого аммония. Высаливание – обратимый процесс. Осадок белка может вновь раствориться в воде после уменьшения концентрации солей путем добавления воды. При этом белок сохраняет свои естесственные биологические свойства.

Ход работы. 1. В пробирку налить 2 мл сыворотки крови и прибавить равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешать.

2. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором наблюдают выпадение осадка белков – глобулинов.

3. Через 5-6 минут осадок отфильтровать в чистую пробирку.

4. В фильтрат для высаливания альбуминов добавить тонко измельченный сухой сульфат аммония до полного насыщения, т.е. до тех пор, пока новая порция порошка не перестает растворяться. Выпадает осадок альбуминов.

Выпавший осадок альбуминов отфильтровать, проверить фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции. Для этого к 0,5 мл фильтрата добавить 10 капель 10 % раствора NaOH и 1-2 капли 1 % раствора CuSO₄.

Принцип метода: реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда солями щелочных и щелочноземельных металлов. Высаливание белков сернокислым аммонием широко используется для разделения белков друг от друга и получения их в кристаллическом виде. Например, глобулины сыворотки крови, имеющие большую молекулярную массу и меньший заряд легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины в насыщенном растворе сернокислого аммония. Высаливание – обратимый процесс. Осадок белка может вновь раствориться в воде после уменьшения концентрации солей путем добавления воды. При этом белок сохраняет свои естесственные биологические свойства.

Ход работы. 1. В пробирку налить 2 мл сыворотки крови и прибавить равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешать.

5. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором наблюдают выпадение осадка белков – глобулинов.

6. Через 5-6 минут осадок отфильтровать в чистую пробирку.

7. В фильтрат для высаливания альбуминов добавить тонко измельченный сухой сульфат аммония до полного насыщения, т.е. до тех пор, пока новая порция порошка не перестает растворяться. Выпадает осадок альбуминов.

Выпавший осадок альбуминов отфильтровать, проверить фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции. Для этого к 0,5 мл фильтрата добавить 10 капель 10 % раствора NaOH и 1-2 капли 1 % раствора CuSO₄

Клиническое значение и практическое применение. В клинических лабораториях метод высаливания используют для разделения и определения соотношения альбуминов и глобулинов.