Методы исследования байстэндер эффекта.

Механизм развития.

Несмотря на то, что в последние несколько десятков лет достигнут большой прогресс в изучении феноменологии РИБЭ, механизм его до сих пор не известен. В литературе рассматриваются 2 возможных механизма его формирования: через межклеточные контакты (опосредуется действием белка р53 и индуцируемого им CDKNIA/p2I — белка, вовлеченного в контроль точек рестрикции клеточного цикла), а также через секрецию во внеклеточную среду специфических факторов (это могут быть цитокины или факторы, увеличивающие внутриклеточный уровень различных форм активного кислорода). Также было показано, что первый механизм не обязателен для формирования РИБЭ.

Впервые доказательства p53 - опосредованного механизма при РИБЭ были получены при исследовании клеток легочного эпителия крыс, облученных малыми дозами α-частиц. Роль межклеточных взаимодействий в этом сигнальном пути была показана позднее, при исследовании эффекта конфлюэнтности культуры первичных фибробластов человека после воздействия малых доз α-частиц. После предварительной обработки клеток линданом, ингибитором межклеточных контактов, повышенный уровень экспрессии белков p53 и p21wa не наблюдался. Также отмечалось изменение экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, таких как p34cdc2, гена циклина В и rad51. При флуоресцентном анализе in situ клеток, в которых приблизительно 2% ядер было облучено малыми дозами α-частиц, наблюдалось увеличение экспрессии p21wa в одних клетках и снижение — в других. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что клеточный контакт является критическим моментом для развития повреждения.

Второй механизм РИБЭ опосредован факторами, экскретируемыми клетками. Этот механизм не зависит от межклеточных взаимодействий. Было показано, что культуральная среда клеток, облученных низкими дозами α-частиц, перенесенная необлученным клеткам, может индуцировать увеличение обменов между сестринскими хроматидами. Индуцирующие РИБЭ факторы непосредственно продуцируются только облученными клетками, с культур которых и собирается среда. В этих экспериментах РИБЭ наблюдался минимум через 24 часа после облучения. Факторы, индуцирующие РИБЭ в культуральной среде доноров, также вызывают увеличение внутриклеточного уровня кислородных радикалов, включая супероксид и гидроксил водорода, которые считаются критическими посредниками в развитии повреждения.

Эффект свидетеля не имеет линейной зависимости от дозы — он максимально индуцируется при воздействии очень малых доз, что предполагает наличие инициирующего механизма активации общего клеточного ответа на повреждение неядерной клеточной мишени. На диплоидных фибробластах человека, облученных α-частицами, было показано участие долговременных р53 -зависимых межклеточных контактов в трансдукции сигнала при его формировании. Также были выявлены и краткосрочные эффекты при переносе облученной α-частицами культуральной среды, не содержащей клеток к интактным клеткам. Однако это, скорее всего, результат формирования свободных радикалов компонентами сыворотки. Действие РИБЭ очень схоже с цитокин-опосредованными эффектами, которые также могут опосредоваться межклеточной передачей сигнала.

При воздействии сигнала, индуцирующего РИБЭ, в клетках могут наблюдаться такие процессы, как индукция апоптоза, геномная нестабильность, усиление клеточного роста либо нарастание частоты генных мутаций, которые, как считалось ранее, могут наблюдаться только при прямом действии радиации. Обнаруживались также повреждения на уровне белков, связанные с РИБЭ и генерализованным стрессорным ответом.

Выраженный байстэндер эффект был показан на иммортализованной культуре кератиноцитов, у которых отсутствует белок р53. С другой стороны, в раковых клетках кишечника SW40, имеющих р53 дикого типа, формируется очень сильный РИБЭ, в то время как в раковых клетках простаты РС3, мутантных по р53, — слабый или вообще отсутствующий. Вполне вероятно, что наличие аллели гена р53 дикого типа облегчает передачу сигнала, а при его отсутствии сигнал передается альтернативным путем.

Существуют данные, свидетельствующие о генетической предетерминации биологического ответа на действие радиации. Так, например, генетически отличающиеся линии мышей отвечают на воздействие радиации по-разному. Также в сравнительных радиобиологических исследованиях были обнаружены значительные колебания в радиочувствительности различных животных. Параллельно с этим, на примере клеток уроэпителия человека были показаны значительные колебания в секреции факторов, вызывающих эффект свидетеля, в клеточную среду. При этом, в клетках, облученных ионизирующей радиацией с низкими ЛПЭ, сигнал и ответ формируются независимо. Например, среда от облученных кератиноцитов может снизить колониеобразующую способность реципиентов — фибробластов MSU 1.1 в 4 раза сильнее, чем колониеобразующую способность самих кератиноцитов. Однако среда от облученных фибробластов не влияет на колониеобразующую способность как кератиноцитов, так и самих фибробластов. Таким образом, культура фибробластов отвечает на сигнал, но не может продуцировать его. В других экспериментах было показано, что среда клеток, мутантных по G6PD и не отвечающих снижением колониеобразующей способности на байстэндер сигнал, подавляет способность формировать колонии у других клеточных линий. Таким образом, клетки могут продуцировать сигнал, но не обязательно на него отвечать. Кроме того, было показано, что один и тот же сигнал может вызывать различные эффекты в разных клеточных культурах.

Несмотря на то, что специфические факторы или сигналы, вызывающие РИБЭ, до сих пор не идентифицированы, было предположено, что в нем могут участвовать экстраклеточный сенсор повреждения ТGFβ1 и фактор индукции апоптоза (АIF), секретируемый митохондриями в ответ на окислительный стресс. Несмотря на то, что АIF действует внутриклеточно, он может активировать высвобождение дополнительных внеклеточных цитотоксических факторов в культуральную среду.

Существует три различных методических подхода для изучения РИБЭ, один из них реализуется с помощью α-частиц, другой — с помощью микропучка заряженных частиц и третий — посредством γ-излучения.

Первый метод — при данной методике вследствие особенностей низкоинтенсивного α-излучения облучаются не все клетки, а только несколько, и исследуемый эффект обнаруживается в необлученных клетках, находящихся в окружении облученных.

В экспериментах по переносу среды от облученных клеток необлученным было показано значительное снижение колониеобразующей способности нормальных и трансформированных клеток эпителия. Облученные клетки секретируют в культуральную среду молекулы, способные поражать необлученные клетки при переносе к ним среды. Среда, облученная вне клеток, не давала никакого эффекта.

В более поздних экспериментах на клетках уроэпителия человека были показаны значительные колебаниям в секреции байстэндер фактора в окружающую среду. Сигнал, вызывающий РИБЭ, зависит от количества клеток в культуре и длительности облучения и действует на необлученные клетки в течение приблизительно 60 часов после облучения. Эффект свидетеля был выявлен при дозах от 0,25 мГр и значительно не увеличивался при их нарастании до 10 Гр. Через 48 часов после переноса среды наблюдалось большое количество апоптотических телец, что свидетельствует о том, что именно апоптоз может быть причиной клеточной гибели в этом случае. Кроме того, в экспериментах наблюдалось также увеличение частоты неопластической трансформации и уровня геномной нестабильности в необлученных клетках.