Идентификация линии методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией

 

Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) (Forsyth & Barret, 1995) позволяет получить ДНК, подходящую для анализа последовательности гена. Путем очистки вирусную РНК можно получить из селезенки (не идеальный вариант ввиду высокого содержания крови в этом органе), лимфоузла или миндалины (идеальный вариант), лимфоцитов периферической крови (РВLs) или мазков с глаз или с поражений в ротовой полости (в зависимости от обстоятельств). Твердые ткани (0,5 –1,0 г) измельчают и гомогенизируют с добавлением 4,0 мл, мазки с глаз и ротовой полости – 1,0 мл, а очищенные лимфоциты периферической крови (из 5-10 мл цельной крови) – с добавлением 0,4 мл денатурирующего раствора в соответствии с опубликованной процедурой. Раствор D (дезинтегрирующий раствор): процедура такова, что согласно рекомендации минимизировать опасность при работе с ядовитым гуанидином тиоцианатом реакцию следует проводить в ламинарном шкафу. Ниже приведены объемы гуанидина тиоцианата для флакона объемом 250 мл, однако, эти объемы можно скорректировать для флаконов другой вместимости. Гуанидин тиоцианат не переносят из флакона, а растворяют во флаконе производителя путем добавления 293 мл стерильной дистиллированной воды, 17,6 мл 0,75 моль цитрата натрия, pH 7,0 и 26,4 мл 10% саркозила, затем нагревают до 65ºC на водяной бане до растворения. Этот раствор можно хранить в течение нескольких месяцев в темном месте при комнатной температуре в ламинарном боксе. Готовый раствор D готовят путем добавления 0,36 мл 2-меркаптоэтанола до 50 мл исходного раствора. Срок хранения раствора – не больше 1 месяца.

 

В последние годы для быстрой очистки высококачественной РНК широко применялись спин-колонки для выделения РНК (RNeasy kit, Qiagen). Полученную в результате РНК преципитируют добавлением 2,5 объемов этанола, промывают в 70% этаноле, растворяют в стерильной воде или в ТЕ буфере (Tris/ЭДТК, 10 мМ, рН 7,5, 1 мМ ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота)) и хранят при –70ºC или при –20ºC до использования. Синтез кДНК осуществляют с использованием случайных шестинуклеотидных праймеров, чтобы на этапе амплификации методом ПЦР можно было использовать нескольких разных специфичных наборов праймеров. Аликвоты полученной кДНК амплифицируют с использованием не менее трех наборов праймеров, способных обнаруживать и дифференцировать чуму КРС и чуму мелких жвачных. Эти наборы праймеров включают два «универсальных» набора на основе высококонсервативных областей в генах фосфопротеина и нуклеопротеина, которые должны обнаруживать все морбилливирусы, и наборы, специфичные для вируса чумы КРС, на основе последовательностей в генах белка слияния этого вируса. Продукты ПЦР анализируют на 1,5% (в отношении массы к объему) агарозном геле с подходящим ДНК-маркером с целью идентификации специфичного ДНК-

продукта. В каждый анализ методом ОТ-ПЦР следует включать положительный контроль, например, РНК вируса кори или вируса чумы плотоядных, и отрицательный контроль, например, стерильную дистиллированную воду вместо РНК. Положительные реакции подтверждают путем использования наборов вложенных праймеров на основе последовательностей гена F или путем секвенирования ДНК-продукта. При исследовании на наличие РНК-вирусов важно использовать на этапе ПЦР более одного набора праймеров, поскольку нуклеотидные последовательности таких вирусов могут значительно варьировать, и одно изменение на 3'-конце последовательности праймера может привести к тому, что амплификации ДНК праймерами не произойдет. Консультацию по использованию данного метода для анализа полевых образцов можно получить во Всемирной справочной лаборатории в Великобритании, которая также является Справочной лабораторией МЭБ по чуме КРС, и Справочной лаборатории МЭБ во Франции (см. Таблицу, представленную в Части 4 данного Руководства по наземным животным).

 

Совсем недавно был описан простой метод ОТ-ПЦР в реальном времени (Taqman) для диагностики чумы КРС. Валидация этого метода ОТ-ПЦР в реальном времени для вируса чумы КРС показала его высокую чувствительность для супернатантов инфицированной тканевой культуры и патологического материала от экспериментально зараженного КРС. Данный метод подтвердил свою способность обнаруживать изоляты, репрезентативные для всех известных филогенетических линий вируса, и четко отличать вирус чумы КРС от вируса чумы мелких жвачных, а также от вирусов других подобных заболеваний (вирус ящура, вирус вирусной диареи КРС, герпесвирус КРС, вирус везикулярного стоматита). Аналитическая чувствительность системы праймеров и зондов L10 превышала 1-100 ТЦД50 (50% тканевая цитопатогенная доза)/мл в зависимости от штамма вируса чумы КРС. Сравнение образцов от экспериментально инфицированных животных показало, что для целей эпизоотологического надзора образцами выбора должны быть эритроциты и мазки с конъюнктивы, которые позволяют поставить диагноз за 2-4 дня до появления клинических признаков. В случае вспышки чумы КРС портативная система ОТ-ПЦР в реальном времени в формате «одной пробирки» позволяет провести доклиническую диагностику, что способствует предотвращению дальнейшего распространения болезни.