Методы распознавания нуклеиновых кислот

Амплификационные методы для выявления генома вирусной ДНК специфичны к роду Capripoxvirus и чувствительны для выявления на всем протяжении развития болезни, включая период до и после возникновения гуморальных иммунных реакций. Данные методы включают традиционную ПЦР, ПЦР в реальном времени и последнюю разработанную изотермическую амплификацию с формированием петель. Методы распознавания нуклеиновых кислот могут использоваться для выявления генома каприпоксвируса в биопсийных пробах, мазках или тканевых культурах.

 

Методы традиционной ПЦР

При проведении некоторых традиционных методов ПЦР сообщалось о различной степени специфичности для каприпоксвирусов в целом, вируса оспы овец или вируса оспы коз (Heine et al., 1999; Ireland & Binepal, 1998; Zro et al., 2014a). Традиционные методы ПЦР, в частности, пригодны для получения достаточного количества генетического материала, необходимого для идентификации видов путем последовательного секвенирования и филогенетического анализа (Le Goff et al., 2009).

 

Методы ПЦР в реальном времени

Разработаны и валидированы несколько высокочувствительных и основанных на специфичности выявления флуоресценции методов ПЦР (Balinsky et al., 2008; Bowden et al., 2008; Das et al., 2012; Stubs et al., 2012). Все тесты позволяют выявлять небольшой консервативный генетический локус в геноме каприпоксвируса, но эти методы не дифференцируют вирус оспы овец, вирус оспы коз или вирус нодулярного дерматоза. Описаны методы ПЦР в реальном времени для прямого генотипирования каприпоксвируса без необходимости генетического секвенирования (Gelaye et al., 2013; Lamien et al., 2011).

 

Изотермическая амплификация генома

Сообщают, что молекулярные исследования с использованием изотермической амплификации с образованием петли (LAMP) для выявления геномов каприпоксвируса обеспечивают чувствительность и специфичность аналогично методу ПЦР в реальном времени, являясь при этом, более простыми и недорогими (Das et al., 2012; Murray et al., 2013). Сообщалось о полевой валидации LAMP метода Das et al., 2012 (Omoga et al., 2016) и о комбинировании данного универсального теста на выявление каприпоксвируса с двумя дополнительными LAMP методами с целью демонстрации их практичности для дифференцирования вирусов оспы овец и оспы коз (Zhao et al., 2014).

 

Серологические тесты

Реакция вируснейтрализации

Тест-сыворотку либо титруют постоянным титром каприпоксвируса (100 TCID50 [50% инфекционная доза в тканевой культуре]) или стандартный штамм вируса титруют постоянным разведением тканевой культуры с целью подсчета индекса нейтрализации. В связи с разной чувствительностью тканевой культуры к каприпоксвирусу и последующей сложности обеспечить использование 100 TCID50, определение индекса нейтрализации является предпочтительным методом, хотя он и требует большего объема тест-сыворотки. Данный тест проводят с использованием 96-луночных микротитрационных плоскодонных планшетов для тканевых культур, но его можно проводить также и в колбах для тканевых культур с внесением соответствующих изменений в используемые объемы, хотя более затруднительным представляется считывание конечной точки титрования в колбе. Сообщают о получении более достоверных результатов при использовании Vero клеток в реакции вируснейтрализации (Kitching & Taylor, 1985).

 

Ход процедуры

i) Тест-сыворотки, включая отрицательный и положительный контроль, разводят 1/5 в среде Игла/ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) и инактивируют при 56°C в течение 30 минут.

ii) Затем, 50 мкл первой инактивированной сыворотки добавляют в колонки 1 и 2, ряды А-Н микротитрационного планшета. Вторую сыворотку помещают в колонки 3 и 4, третью - в колонки 5 и 6, положительную контрольную сыворотку помещают в колонки 7 и 8, отрицательную контрольную сыворотку помещают в колонки 9 и 10, и 50 мкл среды Игла/ HEPES без сыворотки помещают в колонки 11 и 12 и во все лунки ряда Н.

iii) Референтный штамм каприпоксвируса, обычно вакцинный штамм, который хорошо развивается в тканевой культуре, с титром, превышающим log10 6 TCID50 на мл разводят в среде Игла/ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) в мини-флаконах для получения логарифмических серий разведений log10 5.0; 4.0; 3.5; 3.0; 2.5; 2.0; 1.5 TCID50 на мл (эквивалент log103.7; 2.7; 2.2; 1.7; 1.2; 0.7; 0.2 TCID50 на 50 мкл).

iv) Начиная с ряда G и наиболее разведенного вирусного препарата, 50 мкл вируса добавляют в каждую лунку в данном ряду. Повторяют с каждым разведением вируса, наиболее высокий титр разведения вируса находится в ряду А.

v) Планшеты покрывают и инкубируют в течение 1 часа при 37°C.

vi) Клетки LT готовят из предварительно выращенных монослоев в качестве суспензии из 105 клеток/мл в среде Игла, содержащей антибиотики и 2% телячью фетальную сыворотку. После инкубирования микротитрационных планшетов 100 мкл суспензии клеток добавляют во все лунки, за исключением лунок H11 и H12, которые служат в качестве контрольных лунок для среды. Оставшиеся лунки ряда Н – контроли токсичности клеток и сывороток.

vii) Микротитрационные планшеты покрывают и инкубируют при 37°C в течение 9 дней.

viii) Монослои исследуют ежедневно через инвертационный микроскоп, начиная с 4 дня, на наличие ЦПД. В клетках ряда Н ЦПД не должно наблюдаться. Используя вакцинный штамм 0240 KSGP каприпоксвируса, на 9 день считывают окончательное значение, а титр вируса в каждом повторном разведении рассчитывают по методу Карбера. Если оставить на более длительный период, происходит «прорыв» вируса, при котором первоначально инактивированный вирус высвобождается из антитела.

ix) Интерпретация результатов: Индекс нейтрализации - это логарифмическая разница титров между титром вируса в отрицательной сыворотке и в тест-сыворотке. Индекс, составляющий ≥1,5, является положительным. Испытание можно сделать более чувствительным, если сыворотку от того же животного исследовать до и после заражения. Поскольку иммунитет к каприпоксвирусу является преимущественно клеточноопосредованным, отрицательный результат, в частности, после вакцинации, при которой реакция неизбежно слаба, не подразумевает, что животное, от которого была получена сыворотка, не является защищенным.

Реакция нейтрализации, при которой различные разведения вируса смешивают с неразведённой противовирусной сывороткой, описывали с использованием разведений сыворотки в диапазоне от 1/5 до 1/500 и фетальных клеток мышц теленка. Благодаря низкой чувствительности данных клеток к каприпоксвирусу по сравнению с LT клетками, проблема «прорыва» вируса решена.