Методы культивирования анаэробных бактерий

   Культивирование анаэробных бактерий как спорообразующих (клостридии – возбудители столбняка, ботулизма и газовой гангрены), так и неспорообразующих (вейлонеллы, бактероиды и др.) производят в анаэробных условиях (в отсутствии О₂).

Анаэробные условия можно создать следующими методами: физическим, химическим, биологическим.

 

Физические методы

1.Механическое удалениеО₂ с заменой его на инертный газ (в анаэростатах) (рисунок 25).

2.Использование специальных жидких питательных сред. Например, среда Китта–Тароцци, содержащая МПБ,,5% глюкозы и кусочки печени или мясного фарша, необходимые для адсорбции кислорода. Перед посевом кислород из среды Китта–Тароцци удаляют кипячением, охлаждают, производят посев материала, после чего поверхность среды заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками.

 

Рис. 25 Анаэростат для культивирования анаэробных бактерий.

Химические методы

1. Применение поглотителей О₂, таких как щелочной раствор пиргалола на дне эксикатора, в котором на подставку помещают чашки Петри с посевами (рисунок 26).

2. Использование «GasPak – системы» – упаковки, содержащей различные химические соединения, способные в результате взаимодействия с Н₂О, связывать О₂ в герметично закрытых ёмкостях, в которые помещают посевы в чашках Петри или пробирках. Этот метод применяют для выращивания аэротолерантных бактерий (рисунок 27).

3. Использование зажженной свечи на дне анаэростата или эксикатора.

 

Рис.  26    Виды эксикаторов

Рис. 27  GasPak - системы

Биологические методы

При посеве по методу Фортнера чашку Петри с толстым слоем питательного агара делят пополам, удалив полоску среды стерильным инструментом. На одну половину агара сеют культуру аэробных бактерий, на другую – анаэробных бактерий. Пространство между крышкой и дном чашки Петри заливают парафином и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробных бактерий. Когда же они используют из чашки весь кислород, начинается рост анаэробных бактерий (рисунок 28).

 

Рис. 28 Чашка Петри по методу Фортнера

Выделение чистых культур анаэробных бактерий

В практических лабораториях для выделения чистых культур анаэробных бактерий обычно используют метод Цейсслера. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Метод Цейсслера

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы бактерий исследуемый материал засевают на среду Китта–Тароцци. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% раствором NаС1. Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, подписывают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 18-24 часа.

Второй этап. На следующий день посевы просматривают и описывают характер роста. Приготавливают мазки, окрашивают по Граму. микроскопируют, описывая морфологические и тинкториальные свойства бактерий. Затем производят пересев в чашки Петри на сахарно-кровяной агар для получения изолированных колоний. Чашки помещают в анаэростат (либо в эксикатор, или используют «GasPak – системы») и термостатируют при температуре 37 °С 18–24 часа.

Третий этап. Просматривают посевы, изучают изолированные колонии и описывают характер роста. Морфологию бактерий изучают, проводя  микроскопию мазка из колонии, окрашенного по методу Грама. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев подозрительной колонии в пробирку со средой Китта-Тароцци. Пробирки термостатируют 18–24 часа при температуре 37 °С.

Четвертый этап. Отмечают визуально характер роста чистой культуры. Проводят проверку чистоты выделенной культуры, для чего готовят мазок, окрашивают и микроскопируют (чистая культура морфологически и тинкториально однородна).