Сканирующие зондовые микроскопы (СЗМ)

 

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) - один из самых мощных современных методов исследования и получения трехмерных изображений поверхностей тел с высоким пространственным разрешением (до долей ангстрема). В настоящее время практически ни одно серьезное исследование микро и нано структур не обходится без применения методов СЗМ. С помощью СЗМ возможно изучать материалы и биологические объекты в нормальных для этих объектов условиях. Например, изучение биомакромолекул и их взаимодействий, живых клеток и субклеточных органел. Развитие сканирующей зондовой микроскопии послужило основой и для развития новых методов в нанотехнологии – технологии создания структур с нанометровыми масштабами.

Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ) – первый из семейства зондовых микроскопов - был изобретен в 1981 году швейцарскими учеными Гердом Биннигом и Генрихом Рорером. В своих работах они показали, что это достаточно простой и весьма эффективный способ исследования поверхности с пространственным разрешением вплоть до атомарного. В 1986 году за создание туннельного микроскопа Г. Биннигу и Г. Рореру была присуждена Нобелевская премия по физике.

Вслед за туннельным микроскопом в течение короткого времени были созданы атомно-силовой микроскоп (АСМ), магнитно-силовой микроскоп (МСМ), электросиловой микроскоп (ЭСМ), ближнепольный оптический микроскоп (БОМ) и многие другие приборы, имеющие сходные принципы работы и называемые сканирующими зондовыми микроскопами. В настоящее время зондовая микроскопия - это бурно развивающаяся область техники и прикладных научных исследований.

 

Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов

В сканирующих зондовых микроскопах исследование микрорельефа поверхности и ее локальных свойств проводится с помощью специальным образом приготовленных зондов в виде игл. Рабочая часть таких зондов (острие) имеет размеры порядка десяти нанометров и менее. Характерное расстояние между зондом и поверхностью образцов в зондовых микроскопах по порядку величин составляет 0,1 – 10 нм. В основе работы зондовых микроскопов лежат различные типы взаимодействия зонда с поверхностью. Так, работа туннельного микроскопа основана на явлении протекания туннельного тока между металлической иглой и проводящим образцом; различные типы силового взаимодействия лежат в основе работы атомно-силового, магнитно-силового и электросилового микроскопов.

 

Основные элементы сканирующего зондового микроскопа:

· Зонд.

· Сканер (система перемещения зонда относительно образца по 2-м (X-Y) или 3-м (X-Y-Z) координатам)

· Регистрирующая система (фиксирует значение функции, зависящей от расстояния зонд-образец).

· Программные методы управления работой СЗМ и обработки полученных результатов.

 

Процесс сканирования поверхности в сканирующем зондовом микроскопе имеет сходство с движением электронного луча по экрану в электроннолучевой трубке телевизора. Зонд движется вдоль линии (строки) сначала в прямом, а потом в обратном направлении (строчная развертка), затем переходит на следующую строку (кадровая развертка). Движение зонда осуществляется с помощью сканера небольшими шагами под действием пилообразных напряжений, формируемых цифро-аналоговыми преобразователями. Регистрация информации о рельефе поверхности производится, как правило, на прямом проходе.

Локальные СЗМ измерения, как правило, сопряжены с регистрацией зависимостей исследуемых величин от различных параметров. Например, это зависимости величины электрического тока через контакт зонд-поверхность от приложенного напряжения, зависимости различных параметров силового взаимодействия зонда и поверхности от расстояния зонд-образец и др. Данная информация хранится в виде векторных массивов или в виде матриц. Для их визуализации в программном обеспечении микроскопов предусматривается набор стандартных средств изображения графиков функций.

 

Сканирующая туннельная микроскопия (СТМ)

Исторически первым в семействе зондовых микроскопов появился сканирующий туннельный микроскоп. Принцип работы СТМ основан на явлении туннелирования электронов через узкий потенциальный барьер между металлическим зондом и проводящим образцом во внешнем электрическом поле.

       В СТМ зонд подводится к поверхности проводящего образца на расстояния в несколько ангстрем. При этом образуется туннельно-прозрачный потенциальный барьер, величина которого определяется, в основном, значениями работы выхода электронов из материала зонда и образца.

Экспоненциальная зависимость туннельного тока от расстояния позволяет осуществлять регулирование расстояния между зондом и образцом в туннельном микроскопе с высокой точностью. СТМ представляет собой электромеханическую систему с отрицательной обратной связью. Система обратной связи поддерживает величину туннельного тока между зондом и образцом на заданном уровне (I ₀), выбираемом оператором. Контроль величины туннельного тока, а следовательно, и расстояния зонд-поверхность осуществляется посредством перемещения зонда вдоль оси Z с помощью пьезоэлектрического элемента (рис. 8).

 

 

Рис. 8. Упрощенная схема организации обратной связи по туннельному току

 

 

Изображение рельефа поверхности в СТМ может формироваться несколькими методами. Например, по методу постоянного туннельного тока (рис.9) зонд перемещается вдоль поверхности, осуществляя растровое сканирование; при этом изменение напряжения на Z - электроде пьезоэлемента в цепи обратной связи (с большой точностью повторяющее рельеф поверхности образца) записывается в память компьютера в виде функции           Z = f (x,y), а затем воспроизводится средствами компьютерной графики.

 

I_t = const                                                        Z

                        X

 

Рис. 9. Формирование СТМ изображений поверхности по методу постоянного

туннельного тока

 

Атомно-силовая микроскопия

Атомно-силовой микроскоп (АСМ) был изобретён в 1986 году Гердом Биннигом, Кэлвином Куэйтом и Кристофером Гербером. В основе работы АСМ лежит силовое взаимодействие между зондом и поверхностью, для регистрации которого используются специальные зондовые датчики, представляющие собой упругую консоль с острым зондом на конце (рис. 10). Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Регистрируя величину изгиба, можно контролировать силу взаимодействия зонда с поверхностью.

 

Рис. 10. Схематическое изображение зондового датчика АСМ

       Реальное взаимодействие зонда с образцом имеет сложный характер, однако основные черты данного взаимодействия - зонд АСМ испытывает притяжение со стороны образца на больших расстояниях и отталкивание на малых.

Получение АСМ изображений рельефа поверхности связано с регистрацией малых изгибов упругой консоли зондового датчика. В атомно-силовой микроскопии для этой цели широко используются оптические методы (рис. 11).

Рис. 11. Упрощенная схема организации обратной связи в атомно-силовом микроскопе

 

Оптическая система АСМ юстируется таким образом, чтобы излучение полупроводникового лазера фокусировалось на консоли зондового датчика, а отраженный пучок попадал в центр фоточувствительной области фотоприемника.

Основные регистрируемые оптической системой параметры - это деформации изгиба консоли под действием Z-компонент сил притяжения или отталкивания и деформации кручения консоли под действием сил взаимодействия зонда с поверхностью.

При сканировании образца в режиме ∆ Z = const зонд перемещается вдоль поверхности, при этом напряжение на Z-электроде сканера записывается в память компьютера в качестве рельефа поверхности Z = f (x,y). Пространственное разрешение АСМ определяется радиусом закругления зонда и чувствительностью системы, регистрирующей отклонения консоли. В настоящее время реализованы конструкции АСМ, позволяющие получать атомарное разрешение при исследовании поверхности образцов.

 

Зондовые датчики атомно-силовых микроскопов

 

Зондирование поверхности в атомно-силовом микроскопе производится с помощью специальных зондовых датчиков, представляющих собой упругую консоль – кантилевер (cantilever) с острым зондом на конце (рис. 12). Датчики изготавливаются методами фотолитографии и травления из кремниевых пластин. Упругие консоли формируются, в основном, из тонких слоев легированного кремния, SiO₂ или Si₃N₄.

Рис.12. Схематичное изображение зондового датчика АСМ

 

 

Один конец кантилевера жестко закреплен на кремниевом основании - держателе. На другом конце консоли располагается собственно зонд в виде острой иглы. Радиус закругления современных АСМ зондов составляет 1 ÷ 50 нм в зависимости от типа зондов и технологии их изготовления. Угол при вершине зонда - 10 ÷ 20 º. Силу взаимодействия зонда с поверхностью F можно оценить следующим образом:

 

A. = k ⋅ ∆ Z,

 

где k – жесткость кантилевера; ∆ Z – величина, характеризующая его изгиб.

В атомно-силовой микроскопии применяются, в основном, зондовые датчики двух типов – с кантилевером в виде балки прямоугольного сечения и с треугольным кантилевером, образованным двумя балками.

На рис. 13. показаны электронно-микроскопические изображения выпускаемых серийно зондовых датчиков NSG11 с консолью прямоугольного сечения (компания "НТ-МДТ").

 

 

Рис. 13. Электронно-микроскопическое изображение АСМ зонда,

расположенного на прямоугольной консоли

 

Условно методы получения информации о рельефе и свойствах поверхности с помощью АСМ можно разбить на две большие группы – контактные квазистатические и бесконтактные колебательные.

В контактных квазистатических методиках остриё зонда находится в непосредственном соприкосновении с поверхностью, при этом силы притяжения и отталкивания, действующие со стороны образца, уравновешиваются силой упругости консоли. При работе АСМ в таких режимах используются кантилеверы с относительно малыми коэффициентами жесткости, что позволяет обеспечить высокую чувствительность и избежать нежелательного чрезмерного воздействия зонда на образец

В квазистатическом режиме АСМ изображение рельефа исследуемой поверхности формируется либо при постоянной силе взаимодействия зонда с поверхностью (сила притяжения или отталкивания), либо при постоянном среднем расстоянии между основанием зондового датчика и поверхностью образца. При сканировании образца в режиме F_z = const система обратной связи поддерживает постоянной величину изгиба кантилевера, а следовательно, и силу взаимодействия зонда с образцом (рис. 14.). При этом управляющее напряжение в петле обратной связи, подающееся на Z-электрод сканера, будет пропорционально рельефу поверхности образца

При исследовании образцов с малыми (порядка единиц ангстрем) перепадами высот рельефа часто применяется режим сканирования при постоянном среднем расстоянии между основанием зондового датчика и поверхностью (Z = const). В этом случае зондовый датчик движется на некоторой средней высоте Z_ср над образцом (рис. 15), при этом в каждой точке регистрируется изгиб консоли ∆Z, пропорциональный силе, действующей на зонд со стороны поверхности. АСМ изображение в этом случае характеризует пространственное распределение силы взаимодействия зонда с поверхностью.

 

Рис.14. Формирование АСМ изображения при постоянной силе взаимодействия зонда с образцом

 

 

                      

 

Рис.15. Формирование АСМ изображения при постоянном расстоянии между зондом и образцом

 

 

Недостаток контактных АСМ методик - непосредственное механическое взаимодействие зонда с поверхностью. Это часто приводит к поломке зондов и разрушению поверхности образцов в процессе сканирования. Кроме того, контактные методики практически не пригодны для исследования образцов, обладающих малой механической жесткостью, таких как структуры на основе органических материалов и биологические объекты.

 Для исследования таких образцов применяются колебательные АСМ методики, основанные на регистрации параметров взаимодействия колеблющегося кантилевера с поверхностью. Данные методики позволят существенно уменьшить механическое воздействие зонда на поверхность в процессе сканирования. Кроме того, развитие колебательных методик существенно расширило арсенал возможностей АСМ по измерению различных свойств поверхности образцов. 

 В бесконтактном режиме кантилевер совершает вынужденные колебания с малой амплитудой порядка 1 нм. При приближении зонда к поверхности на кантилевер начинает действовать дополнительная сила со стороны образца.

   Формирование АСМ изображения поверхности в режиме колебаний кантилевера происходит следующим образом. С помощью пьезовибратора возбуждаются колебания кантилевера на частоте ω (близкой к резонансной частоте кантилевера) с амплитудой А _ω. При сканировании система обратной связи АСМ поддерживает постоянной амплитуду колебаний кантилевера на уровне A₀, задаваемом оператором (A₀ меньше А _ω). Напряжение в петле обратной связи (на z -электроде сканера) записывается в память компьютера в качестве АСМ изображения рельефа поверхности. Одновременно при сканировании образца в каждой точке регистрируется изменение фазы колебаний кантилевера, которое записывается в виде распределения фазового контраста.

 

Оптические пинцеты

     Оптический пинцет ( лазерный пинцет; оптическая ловушка) — оптический прибор, позволяющий удерживать и перемещать в пространстве микро- и наноразмерные объекты, захваченные в перетяжку (фокус) лазерного луча.

Впервые феномен удержания микроскопических частиц в луче лазера был впервые описан в 1970 г. Артуром Эшкиным (Arthur Ashkin), сотрудником компании Bell Telephone Laboratories в США, который занимался изучением давления света на микрообъекты. В дальнейшем Эшкин и его коллеги продемонстрировали возможности оптической ловушки на основе инфракрасного лазера захватывать, удерживать и перемещать в пространстве различные биологические объекты, такие, как вирусные частицы, одиночные бактериальные и дрожжевые клетки и органеллы в живых клетках водорослей. Захваченные в оптическую ловушку клетки продолжали делиться, что свидетельствовало об отсутствии повреждающего воздействия инфракрасного лазерного излучения на биологические объекты.

В 2018 году А. Эшкину за работы по созданию оптического пинцета была присуждена Нобелевская премия по физике.

Принцип работы лазерного пинцета состоит в том, что оптически прозрачные микрочастицы, имеющие размеры больше длины волны падающего света (например, полистирольные и латексные шарики диаметром около 1 мкм, живые клетки) одновременно отражают и преломляют свет лазера, что приводит, согласно второму закону Ньютона, к возникновению сил отталкивания частиц в направлении от источника света и одновременно сил, возвращающих частицу в исходное положение. При помещении частицы в фокус луча лазера эти силы уравновешиваются, и частица попадает в ловушку. Ее смещение от этого положения вызывает появление дополнительной силы, возвращающей частицу обратно.

Диэлектрические частицы размером меньше длины волны лазерного излучения также захватываются хорошо сфокусированным лазерным лучом. Их поведение объясняется с точки зрения теории электромагнетизма. Диэлектрические частицы поляризуются в неоднородном электрическом поле лазерного луча и смещаются к оси луча, где напряженность поля максимальна.

Открытие А. Эшкина катализировало развитие целого направления оптической манипуляции микрообъектами и разработку новых видов оптических ловушек. В современных оптических ловушках и пинцетах используется один или несколько лазеров и акустооптические преобразователи (для управления лазерным лучом), позволяющие создавать стационарные и подвижные ловушки и работать с несколькими объектами сразу. С помощью таких приборов стало возможным, например. измерить силу, развиваемую одиночными молекулами молекулярных моторов, таких, как миозин и кинезин, а также элементарные шаги, которые делают эти молекулы при двигательном акте (рис. 6)

 

Рис. 16. Измерение силы тяги «молекулярной машины» с помощью оптического пинцета

 

 Благодаря способности манипулировать субмикроскопическими объектами вплоть до атомов и измерять пиконьютонные силы и нанометровые перемещения, оптический пинцет рассматривается как один из важнейших инструментов для нанотехнологий.

С помощью оптического пинцета можно передвигать частицы размером от 10 нм до 10 мкм и собирать из них различные структуры (см. рис. 2):

Рисунок 2. Сложенные с помощью лазерного пинцета различные узоры из гелевых наночастиц.

Интенсивность лазерного пучка максимальна на его оси и плавно спадает к краям. Закон изменения интенсивности соответствует так называемому нормальному, или гауссовскому, распределению, которому подчиняются все природные процессы. Поэтому частица удерживается на оси пучка, а при фокусировке пучка линзой она "втягивается" в точку фокуса и оказывается "пойманной" в трех измерениях. Чтобы создать силы, способные осуществить такую "трехмерную ловушку", требуется излучение мощностью порядка нескольких милливатт.

Объединяя метод оптического пинцета с использованием других лазерных пучков, исследователи могут, например, захватить отдельную хромосому и разрезать на кусочки для дальнейшего анализа. Для захвата можно применить инфракрасное излучение с длиной волны λ=1,064 мкм, а вторую его гармонику - зеленый свет (λ=0,532 мкм) - для разрезания в качестве "оптических ножниц": биологические объекты почти прозрачны в инфракрасной области, но сильно поглощают зеленый свет.

 

 

Тестовые  вопросы к зачету:

 

1. Один нанометр равен

- 10^-6 м

- 10^-9 м

- 10^-12 м

2. Нанотехнологии оперируют с объектами, размеры которых

- 1-100 нм хотя бы в одном измерении

- 1-100 нм во всех трех измерениях

- 1-10 нм во всех трех измерениях

3. Одним из создателей понятия «нанотехнологии» является

- А. Эйнштейн

- Э. Дрекслер

- Н. Виннер

4. Какие из перечисленных объектов не используются в качестве наноносителей при адресной доставке лекарств?

- графты

- дендримеры

- улеродные нанотрубки

5. Конъюгат – это

- наночастица галия

- искусственно созданная наночастица (молекула) в которой соединены наночастицы (молекулы) с разными свойствами

- наноноситель из двух концентрических нанотрубок

6. Липосомы имеют форму

- нити

- полой сферы

- полой трубки

7. Углеродные нанотрубки (УНТ) станут водорастворимыми, если

- предварительно обработать их водяным паром

- присоединить к ним гидрофильный лиганд

- облучить их ультрафиолетовым излучением

8. Вирус может быть использован в качестве наноносителя для адресной доставки лекарств, если

- присоединить лекарственный лиганд к его хвосту.

- присоединить лекарственный лиганд к поверхности его капсида.

- нейтрализовать или удалить генетический материал в его капсиде, поместив в капсид терапевтический материал.

      9. Скаффолд в тканевой инженерии это

- искусственная матрица – аналог внеклеточного матрикса (ВКМ)

- специальный гель для склеивания тканевых сфероидов

- выращенный орган перед его переносом в организм

10. Нановолокна могут иметь длину

- до нескольких нанометров

- до нескольких миллиметров

- до нескольких километров

11. Липосомы

- гидрофильны

- гидрофобны

- в зависимости от способа их получения могут быть как гидрофильными, так и гидрофобными

12. Фуллерены состоят из атомов

- кремния

- фосфора

- углерода

13. Фотостабильность выше у органических люминофоров или у квантовых точек (КТ)?

- квантовых точек (КТ)

- органических люминофоров

- практически одинакова

14. Графт в тканевой инженерии это

- графитовая подложка для выращивания скаффолда

- искусственно выращенный орган или ткань

- тканевый сфероид

15. При биопринтинге, в отличие от классической тканевой инженерии, не используются

- стволовые клетки

- биореактор

- скаффолд

16. Кантилевер это

- упругая консоль с острым зондом на конце

- устройство для перемещения образца в зондовой микроскопии

- острая металлическая игла

17. Какое из перечисленных устройств не является сканирующим зондовым микроскопом (СЗМ)

- туннельный микроскоп

- атомно-силовой микроскоп

- электронный микроскоп

- ближнепольный оптический микроскоп

18. Оптический пинцет представляет собой

- сделанный по технологии МЭМС пинцет из оптически прозрачного материала

- один или несколько сфокусированных лазерных пучков

- пинцет с установленными на его лапках миниатюрным полупроводниковым лазером и фотоприемником

19. Стенки липосом состоят из

- одинарного фосфолипидного слоя

- двойного фосфолипидного слоя

- тройного фосфолипидного слоя

20. Дендримеры имеют форму

- полой сферы

- трехмерной симметричной древообразной с регулярными ветвлениями структуры

- двумерного монослоя

21. Укажите не используемый при сборке дендримеров способ

- дивергентный

- конвергентный

- лазерной абляции

22. Способы получения нановолокон (указать не существующий)

- самосборка

- разделение фаз

- пролиферация

- электроспининг

23. Укажите способ получения наиболее чистых углеродных нанотрубок (УНТ)

- химическое парафазное осаждение

- лазерная абляция

- электрическая дуга

24. Две квантовые точки (КТ), одинаковые по составу, но имеющие разные размеры, были возбуждены от одного и того же источника. Длина волны их люминесцирующего излучения

- одинакова у обеих КТ

- у КТ с большими размерами будет больше

- у КТ с большими размерами будет меньше

25. В тканевой инженерии дифференцировка стволовых клеток происходит

- во время их отбора и культивирования

- во время их нанесения на скаффолд

- в биореакторе

26. Какой из сканирующих зондовых микроскопов не применим для исследования биологических объектов?

- туннельный

- атомно-силовой

27. Каким из устройств можно измерить силу взаимодействия между двумя молекулами

- оптическим пинцетом

- тензодатчиком

- граммометром

Уважаемые студенты заочники!

До субботы 25 апреля (дата зачета) необходимо прислать мне реферат и ответы на тестовые вопросы (номер вопроса и выбранный правильный ответ) – это необходимые условия для сдачи зачета!