Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Протокол обратной транскрипции (синтеза первой цепи кДНК)
Приготовили смесь из компонентов, приведённых в таблице 2, в стерильной пробирке: Таблица 2- Состав смеси для синтеза кДНК
Выбрали необходимый праймер. Аккуратно перемешали смесь, сбросив капли со стенок на микроцентрифуге. Прогрели смесь 2 мин при 70 °C для расплавления вторичных структур РНК и перенесли образцы в лед. Сбросили капли реакционной смеси со стенок пробирки на микроцентрифуге. Добавили 11 мкл предварительно подготовленной смеси, состав которой приведён в таблице 3. Таблица 3- Состав реакционной смеси, добавленного в пробирку с РНК матрицей
Для предотвращения возможной деградации проб добавили в реакцию ингибитор РНКаз. Аккуратно перемешали смесь, сбросив капли со стенок на микроцентрифуге. Инкубировали реакционную смесь 30–60 мин при 37–42 °C. Реакцию проводили в сухом термостате. Для этого наслоили поверх реакционной смеси 1 каплю (15–20 мкл) минерального масла, чтобы объем реакции не изменился из-за испарения. Для остановки реакции прогрели смесь при 70 °C в течение 10 мин. Определение относительного уровня экспрессии генов Относительный уровень экспрессии генов определяли методом количественной ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) на 3-й, 6-й и 9-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из венозной крови из хвостовой вены. Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реальном времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения кДНК. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени использовали интеркалирующий агент SYBR Green. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция данного вещества значительно возрастает при внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.
Высушенные осадки РНК растворяли в обработанной диэтилпирокарбонатомдеионизированной воде. Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра Nano Drop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) по оптической плотности на длине волны 260 нм. Для проведения обратной транскрипции брали 1 мкгРНК каждого образца и помещали в термостат на час при 37-38°С. Для проведения ПЦР по технологии TaqMan (Applied Biosystems, США) к 2 мкл кДНК образцов добавляли реакционную смесь, содержащую МастерМикс и праймеры, приведённые в таблице 4. Таблица 4- Состав реакционной смеси на 1 реакцию, для проведения ПЦР по технологии TaqMan
Амплификацию проводили в термоциклере Real-time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США) по следующей программе: “горячий старт” – +95°С, 5 мин; денатурация – +95°С, 15 сек, отжиг праймеров и элонгация с регистрацией флуоресценции – +56°С, 30 сек (40 циклов) (таблица 5). Таблица 5- Условия термоциклирования
*детекция по каналу SYBR Рисунок 15. Кривые накопления Сt количественной ПЦР на ген Htr 4. По оси ординат RFU – сигнал флюоресценции, по оси функции – количество циклов. Используемый фюоресцентный краситель Sybr. Каталожные номера всех продуктов, используемых в данной дипломной работе приведены в таблице 6. Таблица 6- каталожные номера продуктов
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-07-19; просмотров: 82; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.145.188.160 (0.005 с.) |