Определение белковых фракций сыворотки крови нефелометирческим (турбидиметрическим) методом

Принцип. Различные белковые фракции сыворотки крови способны осаждаться фосфатными буферными растворами определенной концентрации, при этом возникает помутнение смеси из-за образования взвеси. По степени мутности, которую определяют при помощи фотоэлектроколориметра определяют относительное содержание белковых фракций в исследуемой пробе.

Оборудование. Фотоэлектроколориметр, мерные колбы на 100 и 500 мл, пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл, пробирки.

Реактивы. 1.Основной фосфатный раствор: 33,5 г натрия гидрооксида (ч., х.ч.) вносят в мерную колбу на 500 мл добавляют к нему 400 мл дистиллированной воды, потом прибавляют 226,8 г калия фосфата однозамещенного (КН₂РО₄). После полного растворения и охлаждения смеси доводят водой до 500 мл.

2. Рабочие фосфатные растворы. В четыре мерные колбы на 100 мл поочередно вносят 92,4 мл (№1), 74,9 мл (№2), 58,8 мл (№3), 48,7 мл (№4) основного фосфатного раствора и доводят до метки дистиллированной водой. Тщательно перемешивают. Для увеличения сроков хранения можно добавить несколько капель хлороформа.

Возможно использование готовых наборов для определения белковых фракций сыворотки крови, выпускаемых фирмами «Филисит» и «Реагент».

Ход определения. На каждую пробу сыворотки крови устанавливают по шесть пробирок, обозначив их номерами с 0 до 5. В пробирку 0 вносят 10 мл дистиллированной воды, в пробирки №№1-4 по 5 мл соответствующих номеров рабочих фосфатных растворов. В пробирку №5 вносят 0,5 мл сыворотки, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного фосфатного раствора, закрывают пробкой и тщательно перемешивают. После этого переносят по 0,5 мл смеси в пробирки №№1-4 и 1 мл в пробирку №0. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, не допуская образования пузырьков воздуха. Через 15 мин определяют на ФЭКе оптическую плотность растворов в кювете с длинной оптического пути 10 мм при красном светофильтре напротив контроля (проба №0). Начинают колориметритрование с пробирки №4 и т.д.

Расчет ведут по схеме: Е пробирки №1 – Е пробирки №2=Е альбуминов; Е пробирки №2 – Е пробирки №3=Е альфа-глобулинов; Е пробирки №3 – Е пробирки №4=Е бета-глобулинов; Е пробирки №4= Е гамма-глобулинов. Принимая сумму экстинкции альбуминов и всех белковых фракций за 100%, вычисляют относительное содержание каждой отдельной фракции в процентах.

Клиническое значение. Наиболее часто регистрируется понижение уровня альбуминов – гипоальбуминемия. Она отмечается при белковом голодании, при гепатитах, гепатодистрофии, циррозе печени, а так же при нарушениях обмена веществ – кетозе коров и овцематок. Гипоальбуминемия может развиться вследствие нарушения процессов реабсорбции из первичной мочи при нефрозах.

Увеличение концентрации альбуминов встречается реже, в основном при обезвоживании организма.

Уровень альфа-глобулинов повышается при острых воспалительных процессах и при обострении хронических болезней. Уменьшение их свидетельствует о дистрофии гепатоцитов.

Возрастание бета-глобулинов отмечается при хронических инфекциях, нефрозах, нефрите, циррозе печени. Снижение – характерный симптом болезней печени.

Низкое содержание гамма-глобулинов регистрируется при хронических кровотечениях, у новорожденных, при патологиях иммунной системы. Гипергаммаглобулинемия наблюдается бактериальных инфекциях вследствие усиления синтеза антител; так же может встечаться при хронических болезнях печени.

Коллоидно-осадочные пробы

Одним из способов оценки белковосинтезирующей функции печени является проведение коллоидно-осадочных проб. Данный метод диагностики нашел широкое применение не только в гуманной, но и в ветеринарной медицине. В его основе лежит зависимость коллоидной устойчивости сыворотки крови к воздействию химических реагентов от соотношения белковых фракций – альбуминов и глобулинов. При поражении печени происходит нарушение синтеза альбуминов в гепатоцитах, что вызывает развитие диспротеинемии – нарушение нормального соотношения между белковыми фракциями сыворотки крови.

В качестве химических коагулирующих веществ были предложены сулема, тимол, сульфат меди, сульфат цинка.