Полимеразная цепная реакция и клонирование как методы искусственного размножения днк. Основные этапы и применение в медицинской практике.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Суть метода. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига праймеров, элонгации.

Денатурация ДНК-матрицы проводится с помощью нагревания реакционной смеси до 94-96 °С на 5-90 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Следует отметить, что перед первым циклом осуществляют предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации исходной матрицы, что позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Стадия отжига праймеров. При плавном снижении температуры праймеры комплементарно связываются с матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно она на 4-5° ниже расчетной температуры плавления. Длительность стадии - 5-60 с.

Во время следующей стадии - элонгации - происходит синтез дочерней цепи ДНК на матрице материнской. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые ДНК-полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации, в основном зависящее от длины ПЦР-продукта, обычно составляет 1 мин на каждую тысячу пар оснований.

---

Синтез РНК. Ферменты и субстраты синтеза. Особенности синтеза у эукариот и прокариот. Регуляция синтеза.

Как в любом матричном биосинтезе в транскрипции выделяют 5 необходимых элементов:

- матрица – одна из цепей ДНК,

- растущая цепь – РНК,

- субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ),

- источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ.

- ферменты РНК-полимеразы и белковые факторы транскрипции.

Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транскриптон, с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором (конец).

РНК-полимеразы эукариот имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц.

Стадии транскрипции

Выделяют три стадии транскрипции: инициация, элонгация и терминация.

Инициация

Промотор содержит стартовый сигнал транскрипции – ТАТА-бокс. Так называется определенная последовательность нуклеотидов ДНК, связывающая первый фактор инициации ТАТА-фактор. Этот ТАТА-фактор обеспечивает присоединение РНК-полимеразы к той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции (матричная нить ДНК). Так как промотор ассиметричен ("ТАТА"), то он связывает РНК-полимеразу только в одной ориентации, что определяет направление транскрипции от 5'-конца к 3'-концу (5'→3'). Для связывания РНК-полимеразы с промотором необходим еще один фактор инициации – σ-фактор (греч. σ – "сигма"), но сразу после синтеза затравочного фрагмента РНК (длиной 8-10 рибонуклеотидов) σ-фактор отрывается от фермента.

Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед РНК-полимеразой.

Элонгация

Белковые факторы элонгации обеспечивают продвижение РНК-полимеразы вдоль ДНК и расплетают молекулу ДНК на протяжении примерно 17 нуклеотидных пар. РНК-полимераза продвигается со скоростью 40-50 нуклеотидов в секунду в направлении 5'→3'. Фермент использует АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ одновременно в качестве субстрата и в качестве источника энергии.

Терминация

РНК-полимераза остановится, когда достигнет терминирующих кодонов. С помощью белкового фактора терминации, так называемого ρ-фактора (греч. ρ – "ро"), от матрицы ДНК отделяются фермент и синтезированная молекула РНК, которая является первичным транскриптом, предшественником мРНК или тРНК или рРНК.

---