Методы идентификации и разделения аминокислот

Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе.

 Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной и подвижной.

Различают следующие разновидности хроматографии:

- адсорбционная - разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге;

- ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки;

- гель-хроматография, или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой.

Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и г азовая хроматография. Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

6. Напишите структуру пентапептида следующего состава: фен-про-асп-цис-вал. Определите заряд пептида при PH =7;1,5;12. Напишите план мероприятий по определению первичной структуры данного пептида.

рН=7 = -1

рН=1,5 = +1

рН=12 = -2

 шесть основных стадий:

Стадия 1, - определение аминокислотного состава.

гидролиз всех пептидных связей чистого полипептида. Образующаяся смесь аминокислот анализируется затем при помощи ионообменной хроматографии, что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате.

Стадия 2, - идентификация амино- и карбокси- концевых остатков.

идентификация аминокислотного остатка, находящегося на конце полипептидной цепи, несущего свободную альфа-аминогруппу,т.е. на аминоконце (NH2 - конце, или N-конце). Карбоксиконцевой (С- концевой) аминокислотный остаток тоже можно идентифицировать. Один из таких методов состоит в инкубировании полипептида с карбоксипептидазой, которая гидролизует только пептидную связь находящуюся на карбоксильном конце (С-конце) цепи. Определив, какая из аминокислот первой отщепилась от полипептида, при действии на него карбоксипептидазы, можно идентифицировать С-концевой остаток.

Стадия 3, - расщепление полипептидной цепи на фрагменты.

Наиболее распространенный метод для проведения такого расщепления - это частичный ферментативный гидролиз пептида под воздействием пищеварительного фермента трипсина. Этот фермент обладает высокой специфичностью действия: гидролизу подвергаются только те пептидные связи, которые образованы между карбоксильной группой лизина или аргинина и аминогруппой любой аминокислоты.

Стадия 4, - определение последовательности пептидных фрагментов

На этой стадии устанавливается аминокислотная последовательность в каждом из пептидных фрагментов, полученных на стадии 3.

Стадия 5,- расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом

Чтобы установить порядок расположения пептидных фрагментов, образовавшихся под действием трипсина, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо другим способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи устойчивые к действию трипсина. Для этой цели предпочтительнее оказывается на химические методы.

Стадия 6, - установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся фрагментам.

Аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами, сравнивают, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых последовательности отдельных участков совпадали бы с последовательностями тех или иных участков пептидов первого набора. Пептиды из второго набора с перекрывающимися участками позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи.