Лабораторная работа № 2: Кровь как объект изучения. Способ подсчета

                                               эритроцитов. Унифицированный метод подсчета

                                               эритроцитов в счетной камере

 

Цель работы: Подсчет эритроцитов в счетной камере.

Оборудование: Микроскоп, камера Горяева, набор объектов:

 

Краткая теория

Кровь – жидкая ткань, осуществляющая в организме транспорт химических веществ. Кровь выполняет защитную, регуляторную, терморегуляторную и другие функции.

Кровь состоит из жидкой части – плазмы и взвешенных в ней клеточных элементов (см. Приложение). Это сложная многокомпонентная дисперсная система. В норме объем крови у взрослого мужчины составляет в среднем 5,2 л, у женщины – 3,9 л. Среди клеточных элементов различают красные и белые кровяные тельца. На состав крови определенное влияние оказывают половые и возрастные особенности организма, так как картина крови имеет свои особенности в детском и старческом возрасте, а в период с 16 до 60 лет отличаются относительной стабильностью. Половые признаки касаются в основном лишь показателей «красной» крови и скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Так число эритроцитов и гемоглобина у мужчин выше, чем у женщин, СОЭ у женщин приблизительно в два раза выше, чем у мужчин.

Благодаря несколько большей плотности форменных элементов, чем плазмы, после непродолжительного стояния в условиях обычной гравитации или после центрифугирования кровь разделяется на две основные фракции: плазму и более тяжелые, чем плазма, форменные элементы (см. Приложение). Последние составляют около 46% объёма крови. Концентрация эритроцитов в одном микролитре крови описывается величиной, называемой гематокритом (Н). Гематокрит – это объёмная доля эритроцитов в крови. В нормальной крови Н = 0,4. Гематокрит Н связан с концентрацией эритроцитов N₀ и объемом одного эритроцита V_с соотношением  . Эритроциты составляют основную массу форменных массу форменных элементов. Среди форменных элементов суммарный объем эритроцитов примерно в 50 раз превышает объем лейкоцитов и тромбоцитов, в соответствии с чем, реологическое поведение крови определяет количество и механические свойства эритроцитов.

Эритроциты – представляют собой в норме безъядерную двояковогнутую клетку диаметром от 5 до 9 мкм, в среднем 7,2 мкм. Объем клетки – 90 кубических мкм, площадь – 142 квадратных мкм. Наибольшая толщина – 2,4 мкм, наименьшая – 1 мкм. Масса гемоглобина у здорового человека составляет 350–450 г в расчете на 1 м² поверхности тела, или 9–11 г в расчете на 1 кг веса. Масса эритроцитов 27–33 г в расчете на 1 кг веса. Эритроциты благодаря присутствию в них гемоглобина, переносят кислород из легких в ткани организма и несут в легкие из тканей углекислый газ.

 Эритроциты имеют внутреннюю вязкость, которая определяется вязкостью содержащегося в нем гемоглобина. Внутренняя вязкость эритроцита может меняться в больших пределах.

В норме эритроцитов у мужчин 4–5 млн., у женщин 3,9–4,7 млн. в одном микролитре крови. Минимальное содержание эритроцитов в единице объема, при котором еще продолжается жизнь человека, составляет 1 млн./мкл.

Поскольку концентрация эритроцитов в крови значительно превышает концентрацию лейкоцитов и тромбоцитов, то в дельнейшем следует рассматривать кровь, как плазму с взвешенными в ней красными кровяными тельцами – эритроцитами, которые равномерно распределены в слое крови и хаотически ориентированы по отношению друг к другу.

Объектом для исследования служит кровь практически здоровых людей, т.е. лиц, не имеющих заболевания крови или других заболеваний, влияющих на изменение состава, формы или других свойств эритроцитов. При этом средний состав гемоглобина в крови находиться в пределах 130–135 г/л, а концентрация эритроцитов – 3,5–4,5 ·10¹² л^-1. Полученный образец крови делится на части и в последующем, для разведения крови в образцы добавлялся физиологический раствор, и в камере (например, Горяева) подсчитывается количество эритроцитов. Образцы крови забираются из кубитальной вены в области локтевого сгиба в стандартных условиях после 10–12 часового голодания, утром. Чтобы кровь сохраняла свои свойства после забора, в нее добавляют на 10 мл 0,1 мл гепарина. Данный метод стабилизации крови выбран, исходя из того, что гепарин существенно не увеличивает объем крови, т.е. не  разводит её, а с другой стороны гепарин в указанной дозе существенно не влияет на структурно-функциональное состояние форменных элементов крови.

Существует несколько способов подсчета количества эритроцитов.

Фотометрический метод.   Основан на фотометрическом измерении степени поглощения света определенных длин волн взвесью эритроцитов. Процент поглощения света прямо пропорционален числу (концентрации) эритроцитов.

В качестве разводящей жидкости можно использовать 3,5% раствор хлорида натрия. Кровь разбавляют в следующем соотношении 1:500, 1:700 (0,02–0,01 мл крови и соответственно 10–7 мл 3,5% раствора хлорида натрия). Измеряют ослабление на фотокалориметре ФЭК-М при красном фильтре №9 и толщине слоя 0,5 см против компенсационной жидкости, в качестве которой используют тот же раствор хлорида натрия. Снимают показания прибора и определяют количество эритроцитов по специальной таблице, предварительно полученной опытным путем на основании построения калибровочной кривой (сравнивают с камерным методом и подсчетом на электронном счетчике).

Фотометрический метод удобен для серийной работы, однако недостатком его является зависимость результата не только от количества эритроцитов, но и от их размеров, а также от концентрации гемоглобина.