Методы диагностики болезней леса

Диагностика - это распознавание причин болезней с применением различных методов. Постановка диагноза включает определение типа и характера болезни (инфекционный или неинфекционный), возбудителя или причины; оценку вредоносности, определение давности поражения, выявление условий, способствовавших развитию болезни.

Правильная постановка диагноза позволит своевременно определить и предупредить угрозу массового поражения растений болезнями, осуществить профилактические и истребительные защитные мероприятия, не допустить ущерба и неоправданных затрат.

В настоящее время для диагностики болезней леса применяют следующие методы: макроскопический (патографический), микроскопический, микологический, химический и физический. Часто их используют в комплексе.

Макроскопический (патографический) метод дает возможность диагностики болезни невооруженным глазом или при помощи лупы, бинокля в полевых условиях. Этот метод широко применяется в производственных условиях и до настоящего времени остается ведущим. Для правильного распознавания болезней этим методом необходимо проанализировать большое количество экземпляров или органов растений. Такая необходимость вызвана тем, что совокупность признаков болезней может встречаться не на всех растениях или симптомы болезней могут быть не всегда ярко выражены.

Другим условием правильной диагностики является тщательный осмотр больного растения от вершины до корней. У взрослых деревьев крону и ствол осматривают с помощью бинокля, а корневую систему - обнажая 2-3 корня. Кроме того, чтобы сделать правильный вывод, необходимо тщательно проанализировать условия местопроизрастания исследуемых объектов и установить причины, способствующие заболеванию. Далеко не всегда факт наличия болезни говорит о том, что она является причиной ослабления или усыхания растений. Например, в очагах массового усыхания дубрав на стволах и ветвях ослабленных и усыхающих деревьев часто встречаются некрозы (клитрисовый, вальзелловый и др.), которые не являются первопричинами усыхания. Они развиваются на предварительно ослабленных деревьях и лишь ускоряют процесс усыхания.

При осмотре растения обращают внимание на наличие плодовых тел, спороношений, различных видоизменений мицелия (ризоморфы, пленки, склероции и т. д.), типов новообразований (раны, опухоли, трещины и т. д.), гнилей. Легче всего определить возбудителя болезни по хорошо развитым, характерным плодовым телам и спороношениям.

Например, окаймленный трутовик распознают по плодовым телам, имеющим характерную красную или желто-красно-коричневую кайму; клитрисовый некроз дуба определяют по струпьевидно изогнутым, сероватым апотециям; достоверный диагностический признак смоляного рака - эцидиальные спороношения в виде крупных оранжевых вместилищ.

Если плодоношения отсутствуют, то в некоторых случаях можно определить возбудителя по характерным грибным образованиям.

Так, поражение опенком распознают по темным шнуровидным ризоморфам или белым веерообразным пленкам грибницы, а возбудителя эндотиевого рака каштана - по веерообразным пленкам желтого или оранжевого цвета, которые являются диагностическим признаком болезни. Особенности структуры, цвет и другие признаки пораженной трутовиками древесины дают возможность установить вид возбудителя гнили.

Сложнее поставить правильный диагноз, когда есть только признаки патологии, т. е. раны, опухоли, пятна, увядание и т.д. По ним можно установить тип болезни, а для определения возбудителя необходимо применять другие методы. Макроскопический метод дает возможность распознавать возбудителей наиболее распространенных и известных болезней на тех стадиях их развития, когда появляются ясно выраженные внешние признаки. Если по макроскопическим признакам диагноз поставить нельзя, пользуются микроскопическим методом.

Микроскопический метод заключается в исследовании под микроскопом спороношений возбудителей или пораженных тканей растений. Его применяют для определения вида возбудителя или установления наличия патогена в тканях растения. При определении возбудителя под микроскопом исследуют его спороношение. Только микроскопирование дает возможность обнаружить характерные признаки, присущие патогену (у грибов форму и цвет спор, форму сумок, наличие парафиз, характер размещения сумок в плодовых телах и др.). При микроскопическом анализе делают временные или постоянные препараты. В зависимости от характера объектов препараты готовят разными способами.

Если мицелий или спороношения возбудителей (налеты, пленки, пустулы, подушечки) располагаются поверхностно, их соскабливают препаровальной иглой или скальпелем на чистое предметное стекло в каплю воды. Концами препаровальных игл материал расправляют и накрывают чистым покровным стеклом, помещая его на край капли под острым углом. Лишнюю воду с предметного стекла убирают фильтровальной бумагой.

Для установления наличия мицелия в тканях хвои и листьев, определения типов плодовых тел и т. д. лезвием производят продольные или поперечные срезы. Чтобы на препарате четко были видны признаки возбудителя, необходимо делать очень тонкие срезы. С этой целью применяют новые или малоиспользованные лезвия.

Для приготовления срезов хвои выбирают участки с наиболее характерным поражением, вырезают их и помещают в продольный разрез кусочка сердцевины бузины, кукурузы, моркови или в пенопласт. Зажимая левой рукой кусочек хвои между половинками указанного материала, правой рукой движением от себя делают срезы (рис. 1). Из нескольких (5-10) срезов выбирают наиболее тонкие для просмотра под микроскопом.

Плодовые тела рассекают продольно или поперечно. По срезам можно установить тип плодовых тел (апотеции, перитеций, пикниды). Сначала проводят срез через середину плодового тела, отсекая одну половину. По вертикальной поверхности оставшейся половины делают несколько срезов, выбирая затем наиболее удачные для просмотра. Если хвоя или кора сухие, то их предварительно размачивают или кипятят в воде.

Микологический метод заключается в выделении гриба из пораженных частей растений, его изоляции и выращивании на искусственной или естественной среде.

Довольно просто можно выделить грибы из пораженных частей растений, пользуясь методом влажной камеры. Он основан на способности грибницы, находящейся внутри тканей растения, во влажных условиях прорастать наружу и образовывать спороношения. Этот метод не требует стерильных условий и позволяет в довольно короткий срок получать спороношения возбудителей. Он широко применяется для распознавания инфекционного полегания, болезней хвои, семян и др.

Чаще применяют влажные камеры следующего устройства. На дно чашек Петри или Коха помещают четыре предметных стекла, расположенных крест-накрест, а в них - кружок фильтровальной бумаги, закрывают чашку крышкой и стерилизуют в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 160-165°С. Стерилизацию камеры можно проводить более упрощенно. Чашки стерилизуют спиртом, а кружки фильтровальной бумаги - фламированием. Перед помещением исследуемых объектов бумагу в камере увлажняют стерильной дистиллированной или водопроводной водой.

Объекты исследования (всходы, хвою, стволики, корни) перед закладкой в камеру промывают в струе воды и затем стерилизуют. После этого.их раскладывают на фильтровальную бумагу в чашки так, чтобы они не соприкасались друг с другом (рис. 3). Загруженные камеры оставляют в условиях комнатной температуры или помещают в термостат с температурой 20-25°С. Камеры периодически просматривают и по мере необходимости бумагу в них увлажняют стерильной водой из пипетки.

В зависимости от особенностей объекта мицелий, спороношения или плодоношения образуются через несколько дней или недель, после чего проводят микроскопический анализ.

Более сложное выделение патогена из тканей растений осуществляют методом чистых культур, основанным на использовании искусственных или естественных питательных сред.

Для получения чистых культур грибов и поддержания их жизнеспособности в целях дальнейшего изучения применяют различные питательные среды (твердые и жидкие, естественные и искусственные). Выбор того или иного питательного субстрата зависит от потребностей патогена и целей исследований.

Для получения спороношения большинства видов грибов (факультативных сапротрофов и факультативных паразитов) используют суслоагаровую среду, содержащую 7 %-ное неохмеленное пивное сусло и агар-агар, а также агаровую среду, компонентами которой являются вода и агар-агар. Специфические среды для отдельных видов грибов отбирают экспериментальным путем.

Для выделения патогенов, поражающих кору и древесину, обёекты дезинфицируют в 96%-ном этиловом спирте в течение 2 мин или путем фламирования, т. е. стерилизации над пламенем спиртовки. Затем стерильным скальпелем срезают поверхностные слои с образца, а из внутренних вырезают небольшие кусочки размером не более 5х5 мм и стерильным пинцетом переносят их на питательную среду в чашки Петри или пробирки.

При выделении патогена из хвои ее поверхностную дезинфекцию осуществляют путем погружения в одно из следующих веществ: в 70 %-ный или 96 %-ный спирт на 2-3 мин, в 0,1%-ный раствор сулемы на 1-2 мин, в 0,5 %-ный раствор марганцовокислого калия на 30-40 мин. После этого хвою трижды промывают в стерильной воде, разрезают на кусочки размером 5-7 мм и переносят в питательную среду.

Для поверхностной стерилизации семян, хвои, листьев и других мелких частей растений применяют шприцевой способ, предложенный ЭстНИИЛХом.

В простерилизованный шприц помещают анализируемые объекты и наполняют его стерилизующей жидкостью, находящейся в пробирке или в каком-либо другом сосуде. Стерилизацию объектов осуществляют путем поочередного наклона концов шприца в течение требуемого времени. Затем стерилизующий раствор удаляют из шприца через иглу, шприц наполняют стерильной водой, взбалтывают в ней объекты и удаляют воду. Промывание объектов повторяют 3-5 раз, при этом несколько раз стерилизуют кончик иглы шприца над пламенем спиртовки. После этого шприц разбирают, держа его в руке таким образом, чтобы кончик иглы находился близ огня спиртовки. Открытое теперь отверстие шприца выдерживают в течение нескольких секунд в пламени спиртовки или протирают ватой, смоченной спиртом. Затем с помощью стерильного пинцета объекты вынимают и помещают во влажную камеру или в питательную среду.

Для выявления патогенов, обитающих в почве, берут образцы из характерных почвенных разностей на глубине расположения основной массы корней. Собранную почву помещают в бумажные пакеты и в течение нескольких дней высушивают до воздушно-сухого состояния. Затем почву измельчают и высевают на агаровую питательную среду в чашки Пети. По мере развитие колоний грибов их переносят в пробирки на косо разлитую агатовую среду.

Важнейшим требованием при использовании метода чистых культур является соблюдение стерильности посуды, инструментов, одежды, помещения. Нарушение этого требования может привести к загрязнению питательной среды посторонней инфекцией и ошибочным выводам при постановке диагноза.

Работы с чистыми культурами грибов осуществляют в специальных помещениях-боксах (рис. 4). Конструкция и размеры боксов могут быть различны в зависимости от общей площади лабораторного помещения. Бокс должен быть герметичен, изготовлен из легко моющихся материалов (стекла, окрашенных масляной краской фанеры или металла). Для возможности работы при естественном освещении одна стенка бокса должна быть застеклена не менее чем на половину. Однако это не исключает применения электрического освещения.

Химический метод основан на использовании цветных индикаторов, изменяющих окраску водных вытяжек из хвои или листьев, пораженных разными грибами. Подробно химический метод диагностики изложен в книге И.И.Журавлева (1962).

Физический метод основан на различии физических свойств органов и тканей у здоровых и больных растений.

Качества семян определяют по их плотности. Больные семена, имеющие меньшую плотность, всплывают при погружении их в различные жидкости (пресная или соленая вода). Для установления причин поражения пользуются одним из описанных выше способов (выделением в чистую культуру, влажной камерой).

Для выявления скрытой гнили древесины применяют звуковую пробу, основанную на том, что при выстукивании здоровых и фаутных стволов получают разный звук. Этот метод используют как при определении фаутности древостоев, так.ипри обследовании зданий на зараженность домовыми грибами. Однако способ выстукивания не дает точных результатов, так как характер звука зависит не только от наличия гнилей в древесине, но и от других факторов.