Метод окраски культур по Граму

и его особенности для молочнокислых микроорганизмов [71]

Называется в честь  датского врача Г.К. Грама, предложившего метод в  1884 году. Метод исследования позволяет установить наличие бактерий, и дифференцировать их как грамположительных, либо грамотрицательных. Он основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс красителя генцианового фиолетового и йода. Это зависит от особенностей строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий.

 

У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.
		Г+
	У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
Г-

 

Сущность метода: Г + бактерии прочно окрашиваются раствором после обработки йодом. Г - бактерии образуют с кристаллвиолетом и йодом легко разрушающееся под действием этанола соединение.

 

 

Ход работы:

1. Для окраски по Граму следует готовить мазки из молодых культур, находящихся в логарифмической (экспоненциальной) фазе роста (рис. 1), в большинстве случаев это 12-18-часовые культуры. В старых культурах, особенно бульонных, многие штаммы грамположительных бактерий могут окрашиваться грамотрицательно. Предметное стекло для приготовления мазка должно быть тонким, чистым и хорошо обезжиренным. Если стекло плохо обезжирено, можно быстро обезжирить его спиртом. Необходимо профламбировать стекло в пламени горелки (спиртовки).

 

 

Рис. 1 Фазы роста микроорганизмов при периодическом культивировании

 

2.    Можно выделить на стекле зону нанесения мазка. Поместите одну-две капли образца на предметное стекло. Если образец из плотной, полужидкой среды или высушен, предварительно капните на стекло 1-2 капли физраствора. Распределите мазок как можно тоньше по стеклу, например, микробиологической петлёй, стерильным носиком автоматической пипетки, краем другого стекла. Пусть образец высохнет на воздухе при комнатной температуре (рис. 2). Не следует подогревать предметное стекло с нанесённой на него культурой для ускорения высыхания. Нагревание может вызвать деформацию бактерий, вследствие чего возможны искажения окраски и ошибки. Для ускорения высыхания можно перед нанесением материала слегка подогреть предметное стекло.

 

Рис. 2. Порядок нанесения мазка культуры микроорганизма на предметное стекло

 

1. Зафиксируйте мазок, для чего плавным движением проведите предметным стеклом 2-3 раза в пламени спиртовки. Не перегревайте стекло, при этом у клеток некоторых микроорганизмов искажается форма. При нагревании выше 80 ºС происходят необратимые изменения в клеточной стенке бактерий и искажённое восприятие окраски. На зафиксированный мазок наложите фильтровальную бумажку, на неё обильно нанесите карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового (или кристаллвиолет, или кристалфиолет или метилвиолет) на 1-2 минуты (производитель красителя обычно уточняет время необходимой экспозиции) (рис. 3).

.

Рис. 3. Окраска мазка генциановым фиолетовым

 

 

2. Аккуратно снимите фильтровальную бумажку с генциановым фиолетовым. Избыток краски стряхните или даже быстро смойте дистиллированной водой. Нанесите раствор люголя на 1 мин. Содержащийся в нём йод фиксирует окраску. Аккуратно слейте люголь (рис. 4).

Рис. 4. Фиксация генцианового фиолетового люголем

 

 

3. Далее необходимо обесцветить мазок, наливая на предметное стекло этанол, пока стекающая жидкость не станет чистой (30 секунд). Если вовремя не остановиться, обесцвечивание может затронуть и грамположительные бактерии. Нельзя использовать разведённый этиловый спирт. Промыть препарат водой. Мазок докрасьте водным раствором фуксина в течение 1-2 минут. Смойте излишки фуксина. Высушите образец, слегка промокнув фильтровальной бумагой, затем досушив на воздухе. Капните на него каплю иммерсионного кедрового масла. Изучите образец под микроскопом с иммерсионной системой. Г + сохраняют фиолетовый цвет. Г - выглядят розовыми. Все молочнокислые микроорганизмы без исключения Г+.

Рис. 5. Окрашивание мазка фуксином

 

 

Дальнейшая классификация состоит в определении формы бактерии. Часто это бывают кокки (округлые) и бациллы (палочковидные).

Г+  кокками могут быть стафилококки (в виде виноградных гроздьев), стрептококки (Streptococcus), лактококки (Lactococcus) или лейконостоки Leuconostoc), которые образуют цепочки разной длинны); 

Г+  палочки включают в себя лактобактерии (Lactobacillus), бациллы (Bacillus), клостридии (Clostridium), и листерию (Listeria). Также можно обнаружить возбудитель дифтерии.

Г - палочками могут быть эширихия коли (E. Coli), энтеробактерии (Enterobacter), клебсиелла (Klebsiella), цитробактери (Citrobacter), протеи (Proteus), сальмонелы (Salmonella), шигеллы (Shigella), псевдомонас (Pseudomonas)  и др.

 

12.01.2021 г Полянская И.С.