Робота з біологічними об’єктами.

Перед виготовленням зразків біологічних об’єктів для дослідження у ПЕМ та РЕМ необхідно здійснити їх фіксацію, зневоднення, заливання та контрастування.

Фіксація необхідна для збереження тонкої структури біологічного об’єкта, оскільки після смерті організму катастрофічно змінюється структура його тканин. Дрібні частини, такі як спори, клітини, бактерії, водорості, безпосередньо поміщаються у фіксатор. Більш масивні об’єкти, такі як органи тварин, після видалення із істоти поміщаються у фіксуюче середовище, після чого відразу здійснюється його поріз скальпелем на дрібні шматочки. Існує спосіб, пов’язаний із введенням за допомогою шприца фіксатора, коли орган ще не вилучений із живої істоти. Як фіксатор використовують формалін або тетраоксид осмію. Після фіксації орган на 10-15 хвилин поміщається у дистильовану воду.

Наступним етапом є зневоднення біологічного зразка. Метою зневоднення є видалення усієї вільної води, яка знаходиться у біологічному об’єкті. Для цього об’єкт поміщається на годину у спирт або ацетон.

Після зневоднення йде процес заливання, який супроводжується затвердінням об’єкта для подальшого препарування, оскільки з м’якого об’єкта виготовити тонкі зрізи складно.

Як середовища для заливання використовують спеціальні епоксидні смоли, желатин та поліефірні смоли.

Метою контрастування є підвищення контрасту зображення об’єкта. Біологічні об’єкти складаються з хімічних елементів, які мають малу атомну масу (C, N, O, H). Тому при контрастуванні у тканину вводяться атоми важких металів (U, Mо, Ag або W тощо).

Контрастування проводять:

- за життя тварини шляхом добавки до їжі азотнокислого срібла;

- під час зневоднення, завдяки добавлянню до спирту (ацетону), наприклад, фосфор-вольфрамової кислоти або уранолациту;

- шляхом відтінення біологічних об’єктів у вакуумі;

завдяки поміщенню об’єкта у ванну з розчином, що містить солі або кислоти на основі U, Mо, W.

 

Виготовлення тонких зразків з використанням ультрамікротому.

Для дослідження біологічних об’єктів на просвіт необхідно виготовити препарати, що мають достатньо малу товщину (до 100 нм) для просвічування об’єкта електронним пучком. Для виготовлення тонких зрізів використовують прилад ультрамікротом, схема якого наведена на рис. 5.5.

Ультрамікротом монтується на масивній станині (1) у приміщенні зі стабільною температурою, де відсутні протяги та низький вплив зовнішніх вібрацій. Зразок (2), заточений спеціальним чином, кріпиться на тримачі (3), що монтується на кінці важеля (штоку) (4). Шток здатний обертатися навколо точки О за траєкторією (5). Виготовлення зрізу відбувається під час руху штоку вниз. Ніж (7) кріпиться на тримачі (8). Ніж виготовляється зі скла або алмазу, причому при виготовленні зрізів з біологічних об’єктів можливе використання як скляних, так і алмазних ножів, а при виготовленні зрізів із металів використовують алмазні ножі. На ніж кріпиться ванночка з рідиною (9), з якої зрізи виловлюються безпосередньо на мікроскопічну сітку. У процесі роботи оператор може спостерігати за процесом різання в оптичний мікроскоп (11), при освітленні лампою (10). Груба подача зразка під ніж здійснюється механічним способом. Плавна подача забезпечується завдяки тепловому розширенню штоку або із застосуванням п’єзоелектричного ефекту. З використанням цих методів можна отримати достатньо тонкі зрізи з мінімальною товщиною 50 нм.

Рисунок 5.5 – Спрощена схема ультрамікротома

 

За допомогою ультрамікротома можна виготовляти тонкі зрізи з біологічних об’єктів та деяких металевих матеріалів. Якщо виготовляти зрізи із фольги, порошків та стружок, то перед препаруванням необхідно провести заливання зразків легкоплавким сплавом (сплав Вуда, м’який припій).