Глава II. Практическая часть.

Воздействие внешних факторов на амилазу слюны

 

 

Характеристика объекта исследования

Амилаза (син. диастаза — устар.) — общее название ферментов класса гидролаз, катализирующих гидролиз крахмала, гликогена и родственных поли - и олигосахаридов путем расщепления гликозидных связей между 1‑м и 4‑м атомами углерода. α-Амилаза — фермент из группы А. (КФ 3.2.1.1), катализирующий расщепление полисахаридов в организме человека до низкомолекулярных углеводов; определение активности α-A. в сыворотке крови и моче используется в диагностике заболеваний поджелудочной железы, почек, печени, слюнных желез. β-Амилаза — фермент из группы А. (КФ 3.2.1.2), отщепляющий от концов полисахаридных цепей остатки мальтозы с образованием β-мальтозы; используется в клинических исследованиях при диагностике гликогенозов. γ-Амилаза (син. глюкоамилаза) — фермент из группы А. (КФ 3.2.1.3), расщепляющий гликоген и крахмал до глюкозы; играет важную роль во внутриклеточном обмене гликогена.

Процесс расщепления макромолекул крахмала водой идёт постепенно. Сначала образуются промежуточные продукты с меньшей молекулярной массой, чем у крахмала, - декстрины, затем изомер сахарозы – мальтоза, конечным продуктом гидролиза является глюкоза:

Реакцию превращения крахмала в глюкозу при каталитическом действии серной кислоты открыл в 1811 г. русский учёный К.Кирхгоф. Разработанный им способ получения глюкозы в принципе используется и в настоящее время. [11]

 

 

Исследование воздействия внешних факторов на амилазу слюны

Специфичность амилазы слюны

 

Методика приготовления разбавленной слюны:

Рот ополаскивают 2-3 раза водой для удаления остатков пищи. Отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течение 3-5 мин. в несколько приёмов. Собранную жидкость фильтруют через вату, и фильтрат используют для работы.

 

Методика:

В пробирку № 1 поместим 5 мл 5% раствор крахмала.

В пробирку № 2 поместим 5 мл 5% раствор сахарозы.

В обе пробирки добавим 5 мл слюны и 1-2 капли раствора йода.

Опыт повторить 4 раза.

№ пробирки	Содержимое пробирок		Результаты
1	крахмал	амилаза + I2	Проявившееся синее окрашивание со временем исчезнет
2	крахмал	сахароза + I2	Проявившееся синее окрашивание со временем неисчезает

 

Вывод: Ферменты обладают специфичностью. Амилаза катализирует гидролиз крахмала, сахароза не катализирует гидролиз крахмала.

 

 

Действие активаторов и ингибиторов на амилазу слюны

 

Методика:

В пробирку № 1 вносим 1 мл воды.

В пробирку № 2 - 1 мл раствора HCl.

В пробирку № 3 – 1мл CuSO₄.

В пробирку № 4 – 1 мл спирта.

Далее во все пробирки приливаем по 1 мл 5% раствора крахмала, вносим по 1 мл слюны, капаем 1-2 капли раствора йода.

 

№ пробирки	Содержимое пробирок			Окраска с йодом
1	крахмал	амилаза	вода	Проявившееся синее окрашивание со временем исчезает
2	крахмал	амилаза	HCl	Проявившееся синее окрашивание исчезает быстрее
3	крахмал	амилаза	CuSO4	Окраска не изменяется
4	крахмал	амилаза	спирт	Окраска не изменяется

 

Вывод: Ионы Cl активирует амилазу, ионы Сu – ингибиторы для всех ферментов, т.к. типичный металл вызывает денатурацию белка.

Влияние концентрации на активность амилазы слюны

 

Методика:

Нумеруем 10 пробирок.

В пробирку № 1 вносим 1мл воды, в каждую последующую будем добавлять по 2 мл воды.

Далее во все пробирки добавляем по 2 мл 5% раствора крахмала, по 1 мл слюны, капаем по 1-2 капли раствора йода.

 

№ пробирки	Содержимое пробирок		Содержание слюны в растворе, %	Время гидролиза (мин)
1	крахмал	амилаза	50	10
2	крахмал	амилаза	25	20
3	крахмал	амилаза	17	30
4	крахмал	амилаза	12,5	40
5	крахмал	амилаза	10	50
6	крахмал	амилаза	8,3	60
7	крахмал	амилаза	7	70
8	крахмал	амилаза	6,6	80
9	крахмал	амилаза	5,8	90
10	крахмал	амилаза	5	100

 

  Вывод: Чем меньше содержание слюны в растворе, тем медленнее проходит гидролиз.

 

Термолабильность

 

Методика:

В четыре пробирки наливаем по 5 мл 5% раствора крахмала.

В № 1 вносим кипящую воду.

В № 2 – воду, t = -3^оС.

В № 3 – воду, t = 40^оС. 

В № 4 – воду, t = 25^оС.

Через 10 минут добавляем 0,5 мл разбавленной слюны, капаем 1-2 капли раствора йода.

 

№ пробирки	Температура	Окраска с йодом	Время гидролиза
1	100^оС	нет	нет
2	-3^оС	нет	за 15 минут не идет
3	40^оС	Проявившееся синее окрашивание со временем исчезает	7 минут
4	25^оС	Проявившееся синее окрашивание со временем исчезает	11-12 минут

 

Вывод: Наиболее активна амилаза при t = 40^оС (нормальные условия).