Получение посевного материала. Обор-е для произ-го культивирования.

Для получ-я посев.мтериала используют исходную музейную или коллекционную культуру продуцента,к-ая пост-ет в заводскую лабор-ию из науч.-исслед-го института(ВКПМ)или с посевной станции.Взав-ти от вида продуцента ее физиолого-биохим-их особенностей приготовления посев.матер-ла до стадии произв-ых фермент.происходит в неск.этапов:(исх.культ-ра – скошенная агаризованная среда – выращ-е на качалке в колбах на жидкой пит.среде(1-2е стадии) – посевные аппараты(1 или неск.стадий) – стадия произ-ой ферментации.Выращенную культуру 1-5%к объему с поверхности скошенной агар-ой среды стерильно смывают водой и переносят в крнич.колбы на 750мл,содержащий 50-100мл жид.пит.среды.Засеянные колбы выращивают на качалке с опред.кол-ом оборотов(120-140 об/мин при t-ре 28-30С в теч.18-36ч.Выращ-е на качалке ув-ет скорость роста культуры,что связано с хорошим массообменном.Готов-ю к-ру стерильно переносят в стерильный апп-т(инокулятор)с предвор-но простерилзованнойпит.ср.Посев.апп-т снабжен мешалкой,аэрирующим устройством,а также средств.контроля и измерения t-ры,рН среды,уровня пенообразования и т.д.Вместимость посевного аппарата 0,1-10м3,а кол-во стадий выращивания опр-ся объемом произв-ва и нормой расхода посевеого материала для каждого продуцента.Большое значение имеет кач-во посев.мат-ла.Перенос микр-ых клеток с одной стадии выращивания в др. желательно осущ-ть тогда,когда рост популяции происходит с max скоростью,т.е в фазе экспоненциального роста.

Основным апп-ом в схеме микробиол-го прозв-го культивирования яв-ся ферментатор.(пм-посев.мат-л,с-субстрат,т-титрующий р-р,пс-пит.соли,вд-вода,п-пеногаситель,ов-отраб.воздух,в-воздух).

Одной из основных требований предъявляемые ферментатору сохранение стерильности при интенсив.аэрации среды во время всего периода культивирования.Фер-р заполнен стер.пит.средой объем обычно не превышает 70%общего оъема апп-та.Предв. t и рНпит.ср.доводят до опт.значений для данного м/опродуцента.стадия прооизв.культ-ия для большинства м/о 48-72ч в среднем,а для нек.бак.не превышает 24 ч, а для нек.актиномицетов и микроскоп-их грибов может длиться 12 суток.На протяжении всего этого периода растущую глубинную культуру необходимо снабжать кислородом.М/о могут использовать только растворенный кислород.Насыщенные пит.ср.осущ.путем аэрации,обеспечивающий контакт м/у воздушной и жидкой фазой.В проц.культ-ия ведется пост.контроль за состоянием к-ры и накопления продуктов синтеза.Фиксируется потребление основ.компонентов среды (С,N,P,у/в)конталируется рН культур жидкости.

Методы культивирования

Вм/б пром-ти при выращ.орг-ов исп-ют поверхностные и глубинные мет.кул-ия.Их можно представить как ряд стадий,приводящ-их из посев.мат-ла значит.кол-во биомассы или биомассы и продуктов метаболизма. Поверхностный мет. выращ-ия применим только для аэробных к-р,причем их можно вырастить на тв. сыпучей пит.среде или на поверх-ти тонкого слоя жид.среды. во всех случаях, где первоначальный пов-ый метод давал большие выходы продуктов при подборе опр-ых условий в конечном счете глубинный метод оказался более выгодным в пром-ти. Глубинный мет. выращ.м/о может быть периодическим и непрерывным.В период-ом процессе имз-ся скорость роста,физиолого биохим-ие и морфологические показатели к-ры,развитие кул-ры при периодическом способе выращ-ие нач-ся с лаг-фазы,длительность кот-го зависит от условия выращив-ия посевн.мат-ла.Обычно присх-ит перепад концентраций эл-ов питания –снижение в выросшей к-ре,т.е в готовом посевном мат-ле и повыш-ие в засеваемой среде.Далее след-ет экспоненциальная фаза,в этой фазе сведено до минимума влияние лимитирующих и ингибирующих факторов, компоненты пит.среды имеются в избытке,прод-ы обмена еще не накопились,рост к-ры идет с максим-но возможной скоростью,генетически заложенной в клетке.Эта фаза не может быть длительной,т.к со временем популяция начинает испытывать недост-к одном или неск.эл-ов пит-иялибо ингибирующая рост влияния накапливающихся в среде продуктов обмена. Фаза замедления роста может быть очень разнообразна и самой слож-ой.Она может отсутствовать на простых синтетических средах,когда рост сразу прекращается из-за отсутствия одного эл-та пит-ия,особ-но ист.С и энергии.На сложных средах, соджащ-их неск.ист.С может происходить поочередное их потребление и постепенное замедление роста к-ры.При убытке ист-ов пит-ия рост к-ры замед-ся из-за накопления продуктов метаболизма.Далее наступает стационарная фаза. В этой ф.в популяции могут присутствовать разные клетки:Живые,но голодающие;живые,но ингибированные;отмирающие по причине голодания или отравления. Кинетика роста м/о при период-ом культ-ии.

τ-время;x-плотность популяции;1-лаг-фаза,2-переходная фаза,3-экспоненциальная ф,4-ф.затухания роста,5-стационарная фаза,6-ф.отмирания.

Другие условия развития к-ры наблюд-ся при непрерывном культ-ии,задачей кот-го яв-ся поддержание к-ры в динамическом равновесии.Различ.открытые и замкнутые системы непрер.культ-ия. В откр.сист. клетки постоянно вымываются вытекающей жидкостью со скоростью образов-ия в системе нов.клеток.В этих условиях легко достиг-ся их устойч.концен-ия. В замкн.системах клетки в какой-то мере задерживаются в системе и их кол-во все возрастает.Замкнутые системы значительно менее пригодны,чем открытые для осущ-ия точного регулирования всех условий культ-ия,управление и автоматизация процесса.Непрер.процесс может быть гомогенно или гетерогенно непрер-ым. При гомогенно-непрер.процессе в ферментаторе с интенсивным перемеш-ем все параметры(конц.пит.в-в,скорость роста м/о)постоянны во времени.При гетерогенно-непр.проц.неск. ферментатров соед-ют в батарею.При этом не обеспеч-ся постоянные условия роста клеток,т.к в кажд. ферм-ре поддерж-ся постоянные условия култ-ия,но отличные от условий в другом фермен-ре.Мет.проточного култ-ия может быть организован как процесс вытеснения или как пр.полного смешения.при проц.полн.вытестнения сосуд для выращив.м/о предст.собой трубу-тубумерный апп-т,в кот-ом,подается пит.ср.и посевн.мат-л и из кот-го вытекает к-ра.

Модель фермен-ра ид.вытеснения.S0-концентр.субстрата в поступающей среде,х0-плотность подаваемой популяции,S1- концентр.субстрата в вытекающей среде;х1-плотность популяции в вытекающей к-ре.Перемеш-ие к-ры не производится,этот процесс применим для култ-ия анаэробных м/о,когда среда и посев.мат-л поступает фермент-р,клетки нах-ся в начале своего развития.По ходу трубки происходит рвзв-ие к-ры, выражающееся в использовании субстрата,накоплением прод-ов метаболизма и перед вытеканием к-ра нах-ся в сост.аналогичном стационарной фазе ростапериод-ой к-ры. Можно сказать,что в трубке воспроиз-ся полная кривая роста,но не во времени,а в пространстве.Подобная картина наблюдается в батарее проточных ферментаторах.В процессе полного смешения рост к-ры происх-т в емкости ферментатора при интенсивн.перемеш.,достигаемой продувание воздуха и работы мешалки.Во всей массе культуры условия выращивания должны быть одинаковыми.Это гомогенно-непрер.пр.

Ферм-р ид.смешения. S-концентр.субстрата в ферм-ре,х-плотность подаваемой популяции в ферм-ре.При гомогенно-непрер.пр.в ферм-ре могут быть созданы условия,соотв-щие любой точке кривой роста к-ры,выращ-ой периодическим способом.При быстром протоке среды эти условия близки к условиям экспонециального роста.При медленном-прибл-ся к условиям стационарной ф.В установ-ся режиме удельная скорость протока среды=удельн.скор.роста к-ры.При этом к-ра нах-ся в сост.динамического равновесия и обладает способностью автоматически подстраиваться к имз-ям условий.Хорошо отработанный период-ий проц.выращивания экономически выгодно воспроизводить проточным мет-ом культ-ия.Т.к к-ра непрер-но нах-ся в состоянии масимальной активности и не тратиться время на подготовку ферм-ра,его заполнения,смыви лаг-фазу.при гомогенно-непрер.култ-ии можно осущ-ть недоступ-ое при периодич.култ-ии ограничение роста к-ры одним эл-ом питания.При не лимитирующем кол-ах остальных эл-ов.При медленном протоке огран-ие роста будет сильным,при-быстором-слабым.Такое непрер-ое култ-ие наз-ся хемостатным. Т.к рост м/о регулирует хим-ие факторы среды.Двустадийное култ-ие двух послед-но соед-ых фермен-ов позволяет достичь максим-ой скорость роста и даже превзойти ее.Для этого в первом ферм-ре батареи ведется нормальное к-ие при скорость протока меньше мах возможной скорости роста в одном апп-те.А во второй подается к-ра из первого и свеж.среда.

 

S0-концентр.субстрата в поступающей среде,х-плотность популяции в 1-ом ферм-ре,S- концентр.субстрата в ферментаторе;х1-плотность популяции во 2-ом ферм-ре, S1- концентр.субстрата во 2-ом ферментаторе.Во 2-ом ферм-ре повыш-ся скор-ть протока вплоть до превышения мах возмож.скор-ти роста,а вымывание не происходит,т.к из 1-го ферм-ра непрер.поступает к-ра.мах-я скор-ть роста может быть достигнута при турбиостатном култ-ии,при кот-м контроль за проц.осущ-ся с пом.изм-ия конц-ии м/о.Для этого ферм-р снабжают прибором для нефелометрического опр-ия конц-ии клеток(мутности) характер-щей конц-ию популяции в фермент-ре.Этот мет-д култ-ия применяют для выращ-ия м/о на прозр-ых средах.При низких конц.субстрата и не высокой плотности популяции можно возвратить в ферм-р часть клеток вместе с вытекающей из нее КЖ,чтобы повысить конц.клеток и ускорить проц.Сущ-ет неск.вариантов возврата,н-р,сепарируют вытекающую к-ру и сгущенную чать КЖподают в ферм-р.Можно уст-ть после ферм-ра фильтр-щее устр-во.