Глава 2. Методика исследования

Изучение влияния газового состава воздуха на микрофлору.

Общие сведения

При составлении питательных сред необходимо учитывать потребность микроорганизмов в элементах питания. По составу среды подразделяют на две группы: естественные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов живого или растительного происхождения и имеют сложный неопределённый химический состав. Их основа – различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озёр и минеральных источников. Большинство таких сред используют в виде экстрактов или настоев.

На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в них есть все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределённым составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а также выяснить, какие вещества синтезируют микроорганизмы.

Указанные недостатки связаны с тем, что состав естественных сред очень сложен и не постоянен, существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

Синтетические среды – это такие, в состав которых входят в точно указанных концентрациях только известные химически чистые соединения. Данные среды по составу бывают простыми и с относительно сложным набором компонентов. Синтетические среды широко используют для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

Существуют так называемые полусинтетические среды, относящиеся к средам с неопределённым составом. В них наряду с соединениями известной химической породы входят вещества неопределённого состава. Например, в мясо-пептонную среду кроме сложных и неопределённых по химическому составу веществ (мясной бульон) иногда входят пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфат калия; картофельные среды содержат глюкозу и пептон. Полусинтетические среды широко используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Питательные среды могут быть различной концентрации: жидкие, плотные, полужидкие. Плотные питательные среды используют для учёта количества бактерий, выделения чистой культуры и других целей.

Агар-агар – это растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным содержанием азотистых веществ. Желатина – кислый азотосодер-жащий продукт, добываемый при выпарке костей и хрящей. Плотными пита-тельными средами служат также гелевые пластины, введенные в микробиоло-гическую практику С. В. Виноградским.

Для выращивания микроорганизмов, усваивающих органические формы азота, часто употребляют мясо-пептонную желатину.

Мясо-пептонный агар (МПА)

Добавляют 1 л МПА 15 - 20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агар-агара (температура плавления его 100°С, застывания 40°С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-м раствором Na₂CO₃ и через воронки разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агар-агара столбиком для разлива в чашки Петри, по 5 мл – для полу-чения скошенного, наклонного агара)

При разливе необходимо следить за тем, чтобы края пробирки были сухи-ми, иначе пробки будут прилипать к стеклу. Пробирки со средой стирилизуют 20 мин в автоклаве при 120°С.

Агар Сабуро

Питательная среда предназначена для выращивания и подсчета общего числа дрожжевых и плесневых грибов. Представляет собой студнеобразную массу темно-ко­ричневого цвета.

Агар Сабуро с глюкозой и хлорамфениколомрекомендуют для селектив-ного культивирования дрожжевых и плесневых грибов, а Агар Сабуро с глюкозой используют также для культивирования кислотолюбивых бактерий.

Состав: пептон ферментативный, глюкоза, агар.

Приготовление: размешать 65,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать в течение 15 мин. При разливе необходимо следить за тем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки будут прилипать к стеклу. [13]

Стерилизация текучим паром

Текучим паром (100°С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (например, среды с углеводами). Данную стерилизацию выполняют в кипятильнике Коха в течение трёх дней по 30 минут ежедневно. Эту стерилизацию называют дробной.

Кипятильник Коха представляет собой высокий металлический цилиндр с двойным дном, свободно закрывающийся конусообразной крышкой с отверстием для термометра. Снаружи цилиндр покрыт асбестом или линолеумом. На дно кипятильника наливают воду, устанавливают подставку с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые предметы. Продолжительность стерилизации отсчитывают с момента интенсивного выхода пара из-под крышки и повышения температуры до 100°С.

При однократном прогреве при температуре 100°С за 30 минут погибают вегетативные клетки, споры, не многих организмов остаётся жизнеспособными. После такого прогрева среду помещают на 24 часа в термостат при температуре 28 – 30°С. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают за это время прорасти в вегетативные формы, которые при последующем нагревании погибают. Всю операцию повторяют три раза.