Методи визначення N-кінцевих амінокислот

Реакція з динітрофторбензолом (реакція Сенгера). Динітрофторбензол реагує з аміногрупою амінокислоти і, звільняючи фтористоводневу кислоту, утворює динітрофеніламінокислоту (ДНФ-ак):

 

Ця реакція може відбуватися і за участю амінокислот, що входять в білок, але тільки по їх вільних аміногрупах. Якщо після завершення реакції провести гідроліз білка, то всі амінокислоти вивільняються. Гідроліз не порушує структуру ДНФ-ак. Використовуючи розчинність ДНФ-ак в органічних розчинниках, можна відділити, а отже і ідентифікувати амінокислоти, які, знаходячись у складі білка, мали вільні аміногрупи.

Реакція з 1-диметиламінонафтил-5-сульфонілхлоридом (дансилом, ДНС-метод). Більш чутливим, ніж динітрофенільний, є дансильний метод визначення N-кінцевих амінокислот. Суть цього методу полягає в тому, що N-кінцева амінокислота пептиду в лужному середовищі взаємодіє з 1-диметиламінонафтил-5-сульфонілхлоридом (дансилом). При цьому утворюється диметилнафтилсульфоніл-білок (ДНС-білок):

 

Далі здійснюють кислотний гідроліз ДНС білка 20% розчином HCl, що призводить до утворення вільних амінокислот і N-кінцевої амінокислоти у вигляді ДНС-похідного:

 

Після цього ДНС-амінокисоту, завдяки інтенсивній флуоресценції дансильних груп, виявляють і кількісно визначають.

Реакція з фенілізотіоціанатом (реакція Едмана). Фенілізотіоціанат в слаболужному середовищі реагує з аміногрупою:

 

У слабокислому середовищі продукт цієї реакції циклізується. Якщо піддати амінокислоту, яка входить до складу білка, дії фенілізотіоціаната, то її можна виділити й ідентифікувати у формі фенілтіогідантоїнового (ФТГ-ак) похідного:

 

Цей метод дозволяє ідентифікувати кінцеві амінокислоти білка, аміногрупи яких вільні. Утворення ФТГ-ак не вимагає гідролізу решти частини білка.

Для визначення N-кінцевих залишків амінокислот крім хімічних методів використовують також і ферментативні. З цією метою використовують фермент з групи екзопептидаз – лейцинамінопептидазу, яка діє на пептид з N-кінця.

Кольорові реакції. Нінгідрин здійснює декарбоксилування a-амінокислот з утворенням СО₂, NH₃ і альдегіду, який містить на один атом вуглецю менше, ніж вихідна амінокислота. Відновлений нінгідрин реагує з вільним аміаком, утворюючи блакитний комплекс з максимумом поглинання при l_max=570 нм:

 

Утворення цієї забарвленої сполуки використовується в кількісному тесті на a-амінокислоти, за допомогою якого є можливість виявити їх, якщо навіть вони знаходяться у концентрації до 1мкг. Нінгідрин реагує не тільки з амінокислотами, але і з другими амінами; при цьому також утворюється блакитне забарвлення, але не виділяється вуглекислий газ. Таким чином, саме виділення СО₂ є індикатором участі в реакції a-амінокислоти. Аміак і пептиди також вступають в реакцію з нінгідрином, але менш активно ніж a-амінокислоти. Продукт реакції між проліном (гідроксипроліном) і нінгідрином має жовте забарвлення.