Вкористання клітинних культур у вірусології. Класифікація культур клітин. Поживні середовища для культивування культур клітин.

Культури клітин – це популяція однотипних клітин організму людини чи тварини, яка вирощується в штучних умовах і призначається для культивування вірусів. За тривалістю життя клітинні культури поділяються на: 1)первинні,2)напівперещеплювані,3)перещеплювані.

Вирощують культури клітин в стерильних умовах у спеціальному плоскому скляному посуді, в який додають живильні середовища, які містять фізіологічну кількість амінокислот, вуглеводів, мінеральних солей, рН=7.2-7.4.Також є індикатор, який змінює колір при зсуві р зсуві рН від оптимального.Найчастіше використовується середовище 199(яке включає 60 компонентів і застосовується для перещеплюваних і первинно трипсинізованих клітин) і Ігла(містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів,використовують для культивування диплоїдних і перещеплюваних клітинних культур).Для забезпечення асептичних умов в живильні середовища додають антибіотики.

Первинні – одержують з тканин тварин і людини шляхом їх ферментативної дезінтеграції. Шматочки тканини поміщають у 0,25% роз-н трипсину при температурі 37С і періодично перемішують. У результаті цього відбувається відділення клітин тканини одна від одної. Порції клітин збирають у міру відділення, центрифугують, трипсин зливають, вносять середовища росту і суспендують в ньому клітини. Первинні культури клітин можуть проходити до 10 поділів in vitro, мають високу чутливість до багатьох вірусів, можуть бути отриманні у великій кількості, безпечні в онкогенному відношенні. Недоліком первинних культур є значна праце місткість і тривалість одержання, а також можлива контамінація латентних вірусів. До первинних культур клітин належать клітини нирки ембріона людини, макаки резус, ембріона свині, фібробласти курячих ембріонів.

Напівперещеплювані – є диплоїдними клітинами одного типу, які спроможні здійснювати in vitro до 100 поділів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. До напівперещеплюваних належать фібробласти ембріона людини. Ці клітини надзвичайно вимогливі до умов культивування, тому в практиці вірусологічних лабораторій мають обмежене застосування.

Перещеплювані культури клітин – це однотипні пухлинні або нормальні клітини людини і тварини зі зміненим стереотипом, що необмежено ростуть in vitro.До них відносяться клітини HeLa –клітин карциноми шийки матки,клітини карциноми порожнини рота людини – КВ, Vero –клітини нирки зеленої мавпи, СПЕВ (клітини нирки ембріона свині),клітини карциноми гортані людини.

 

Індикація вірусів: р-ія гемаглютинації, р-ія гемадсорбції, цитопатична дія(ЦПД), її виявлення.

Індикація вірусів – це виявлення їх в досліджуваному матеріалі без встановлення їх родинної, родової, видової приналежності чи сероваріанту.

Р-ція гемаглютинації ґрунтується на спроможності деяких вірусів, що міст гемаглютиніни на зовнішній оболонці, склеювати еритроцити людини чи певних видів тварин. Для проведення РГА використовують вірусовмісну рідину, яку змішують з 0.5 мл ізотонічного розчину і 0.5 мл 1%суспензії відмитих еритроцитів. Інкубують при37(20 або 4С в залежності від властивостей вірусу).Якщо результат негативний – аглютинація не розвивається, отже в досліджуваній рідині вірусу немає. Якщо спостерігається аглютинація – результат позитивний, отже в досліджуваній рідині наявний вірус. Контролем є суміш з 0.5мл еритроцитів з 0.5 мл ізотонічного розчину натрій хлориду,який не містить вірусу.

Р-ія гемадсорбції – виявляє віруси, що містять гемаглютиніни, у клітинах до розвитку ЦПД. Гемадсорбція спостерігається, коли гемаглютиніни присутній на цитоплазматичній мембрані клітини. Р-ія Гадс проводиться шляхом внесення в клітинну культуру 0.2 мл 0.5% суспензії еритроцитів, клітини інкубують 15-20хв при37С(20С або 4С, в залежності від властивостей вірусу).Потім пробірки струшують для видалення не адсорбованих еритроцитів і враховують під малим збільшенням мікроскопа їх скупчення на окремих клітинах ч на цілому моношарі. Якщо клітини не інфіковані вірусом, адсорбції еритроцитів на їх поверхні не буде спостерігатись.

ЦПД –це морфологічні зміни в культурах органів і тканин, які виникають у процесі репродукції вірусів у клітинах. Віруси з ЦПД називають цитопатогенним. Характер ЦПД залежить від властивостей, дози вірусу, властивостей самої клітини і умов її культивування.

ЦПД може проявлятися:

- некрозом – більшість клітин руйнується, інші зморщуються(пікноз ядра і цитоплазматичної мембрани, вакуолізація), для них характерна подвійна променезаломлюваність – сильне світіння при мікроскопії.

-гроноутворенням – клітини округлюються, збільшуються, частково зливаються між собою з утворенням гроноподібних скупчень.

-симпласто- і синцистоутворенням – синтицій складається з клітин, сполучених цитоплазматичними містками, симпласт – це велика багатоядерна клітина, яка утворилась в результаті багатоядерних незавершених мітозів

-круглоклітинною дегенерацією – округлення клітин і втрата ними міжклітинних зв’язків,, може також спостерігатися пікноз, зморщування і деструкція клітин.

- клітинною проліферацією

- осередковою деструкцією – на фоні збереженого в цілому моношару з’являються осередки ураження клітин(мікробляшки)

При відсутності або слабко вираженій ЦПД проводять зараження культурною рідиною нових культур клітин